微孔板式化学发光酶联免疫法检测金黄色葡萄球菌肠毒素B方法的建立及应用

论文摘要

金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxin, SE）是金黄色葡萄球菌分泌的细菌外毒素。SE主要分为SEA、SEB、SEC、SED、SEE五型,SEC可分为SEC1、SEC2和SEC3三种亚型。有学者将中毒性休克综合征毒素（toxic shock syndrome toxin 1, TSST-1）称为SEF。SE各型的分子量相近,约为2630kDa,在高温条件下和经过蛋白水解酶的作用后,SE仍可保持生物学活性。各型SE在结构和功能上具有相似性。随着新的检测技术的发展和应用,一些新型SE或与SE引起的食物中毒有密切相关的毒素相继被发现。肠毒素是根据其引起呕吐的性质来命名的,已经确定与呕吐反应有关的新型肠毒素分别是SEG、SEH和SEI,另有与SE食物中毒有密切相关的毒素（SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER、SEU和SEV）,其致吐作用尚未确定,这些相关毒素被命名为“staphylococcal enterotoxin–like （SEl） SAgs”,即“金黄色葡萄球菌肠毒素样超抗原”,上述相关毒素可称为SElJ-SElV。SE最突出的特点是具有超抗原活性。超抗原（Superantigen, SAg）指具有丝裂原作用,仅需要极低浓度（110ng/ml）就可以激活2%20%T细胞克隆,使淋巴细胞增殖,产生极强的免疫应答的一类抗原。SAg可分为T细胞超抗原和B细胞超抗原。T细胞超抗原可根据其作用的T细胞受体类型分为TCRγδ型超抗原和TCRαβ型超抗原,SE属于TCRαβ型超抗原。SE对免疫系统有免疫激活作用,其分子的一端与抗原提呈细胞上MHCⅡ类分子抗原结合沟槽α螺旋的外侧结合,另一端同T细胞表面TCR的某些Vβ基因编码片段结合,形成MHCⅡ类分子-SE-TCRVβ三重复合物。MHCⅡ类分子和SE组成的复合体与TCR结合不紧密,SE激活一个T细胞后解离可激活其它的T细胞,这样就使得少量SE能够激活多克隆的T细胞。T细胞被激活后,产生多种细胞因子,如IFN-γ、IL-2、CSF和TNF-α等,参与某些病理过程的发生和发展。不同金黄色葡萄球菌菌株产生的SE种类差别较大,同一菌株可产生多种SE。另一方面,不同肠毒素基因序列间相似性较高,部分毒素基因存在密切的连锁关系。为充分认识和理解各型肠毒素的致病机理,需要对不同菌株中各型毒素的分布、各毒素基因型间的关系、毒素蛋白的表达和性质进行深入细致的研究。SE引起的食物中毒在细菌性食物中毒中占有很高的比例。SEB的半数致死剂量（LD50）约20ng/kg,半数有效剂量（ED50）约0.4ng/kg可以致残。SEB性质稳定,而且易于制备,能够以气溶胶的形式散布。SEB被美国疾病控制中心确定为B类生物战剂。因此,在食物、水源和人的体液中能检测出低剂量SEB的高灵敏度和高特异性的方法对食品安全卫生和反恐怖战争具有十分重要的意义。随着对SE研究的日益深入,检测SE的方法也得到不断的发展和提高,向着高特异性、高灵敏度、简便、快速的方向发展。传统的方法,如反向被动乳胶凝集法（RPLA）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光技术（immunofluorescence technique）等,由于灵敏度较低,其应用受到了很大的限制。Khreich等使用免疫荧光技术能够在检测缓冲液中检测到的0.02ng/mL的SEB。近年来,建立在抗原抗体相互作用基础上的生物传感器技术在检测SEB领域得到广泛应用。如表面等离子共振生物传感器（Surface plasmon resonancebiosensor, SPR）、共振声谱分析（Resonant acoustic profiling, RAP）、生物半导体技术（Biological semiconductors, BSCs）、流动注射电容生物传感器（Flow-injection capacitive biosensor）等。生物传感器检测灵敏度高,如流动注射电容生物传感器能检测到最低剂量为0.3pg/ml的SEB,但生物传感器价格昂贵,不适合进行高流通量检测,目前主要应用于科学研究。化学发光酶联免疫检测法（Chemiluminescent immunoassay, CLEIA）因其具备灵敏度高、较宽的线性动力学范围以及简便快速等特点,现已得到广泛应用,其灵敏度可以和放射免疫检测相媲美。CLEIA的基本原理是化学发光的强度和反应物或产物的浓度呈正比。CLEIA是建立在抗原抗体复合物基础之上,因此具有极高的特异性和灵敏度。CLEIA中常使用的标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）等。抗体和酶是影响CLEIA灵敏度的两个关键因素。我们筛选出一对特异性强的抗体配对,使用辣根过氧化物酶标记抗体,利用鲁米诺作为发光底物,建立了具有高度灵敏的微孔板式CLEIA检测SEB的方法。微孔板式CLEIA与电化学发光（electrochemiluminescence, ECL）和生物传感器相比,具有操作简便的特点,检测速度快,约2分钟就可以完成一块96空板的检测,能满足需要高通量运行的临床检测的需要。本研究中,我们使用常规方法制备了20株针对SEB分子的单克隆抗体,并进行了腹水效价测定和抗体表位鉴定,从中筛选出两株效价高、特异性强,识别不同表位组的两株单抗组成抗体配对,并对CLEIA的反应条件进行了优化。本方法的线性动力学范围在0.01-5ng/mL之间,实际可测的检测限（limitof detection, LOD）达到0.01ng/mL,批内和批间变异均小于13%。本方法特异性强,与SEA、SEC1和SED之间不存在交叉反应,可用于不同基质中SEB的检测,如污水、自来水、河水等环境基质;烤牛肉、花生酱、熏火腿、10%脱脂奶粉、牛奶、橙汁等食品基质;人尿液、血清等体液基质。我们建立的微孔板式CLEIA检测SEB的方法具有高特异性、高灵敏度,操作简单等优点,在公共卫生和军事侦察领域具有广阔的应用前景。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 金黄色葡萄球菌肠毒素概述
• 2 金黄色葡萄球菌肠毒素的检测
• 第一部分 微孔板式化学发光酶联免疫法检测SEB 方法的建立及应用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 SEB 中和抗体Fab 段的制备
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢