肝星状细胞自噬现象的特征鉴定及其生物学意义的研究

论文摘要

目的：在确认肝星状细胞存在自噬现象的基础上，通过体外调节肝星状细胞的自噬水平，观察自噬水平改变对此细胞增殖及前胶原表达的影响，探讨以自噬信号通路为靶点治疗肝纤维化的可行性，为抗肝纤维化治疗提供新的理论依据。方法：1.梯度密度法分离、原代培养大鼠肝星状细胞（HSC），光镜观察细胞生长情况;2.通过透射电镜观察大鼠HSC发生自噬时的超微形态学特征；3. MDC染色法结合荧光显微技术观察HSC中的自噬溶酶体的形态改变；4.Western-blot技术检测HSC中自噬信号分子蛋白的表达；5.Real-time PCR技术检测HSC中Ⅰ型前胶原mRNA的表达；6.通过CellTiter96Non-Radioactive Cell Proliferation Assay （MTT）方法分析HSC的增殖情况；7.通过流式细胞术检测HSC的细胞凋亡率。8.通过自噬信号促进剂、抑制剂的应用，观察HSC自噬水平的应答变化，分析与HSC增殖、胶原生成等靶效应间的关系。结果：本研究通过梯度密度法成功分离和原代培养大鼠肝星状细胞，在此基础上，1.观察到荧光显微镜及扫描超微电镜下的HSC自噬表现特征；检测到HSC中存在自噬信号通路相关分子的表达。2.与对照相比，用EBSS培养液饥饿培养法，可诱导出HSC中自噬体数量明显增加。用自噬促进剂Rapamycin孵育HSC可刺激细胞自噬通路分子ATG5、beclin1、LC3II的表达升高；而自噬抑制剂3MA显著下调HSC中这些自噬分子的表达。3. Real-time PCR检测显示，自噬抑制剂3MA减少HSC中Ⅰ型前胶原mRNA的表达；相反，自噬促进剂Rapamycin使HSC中Ⅰ型前胶原mRNA的表达升高。此外，MTT分析显示，自噬抑制剂3MA抑制肝星状细胞的增殖，呈浓度依赖性。4.用重组人TGFβ1明显刺激HSCⅠ型前胶原mRNA转录增加；再加入Rapamycin后，发现可进一步上调细胞Ⅰ型前胶原mRNA水平；TGFβ1诱导的Ⅰ型前胶原mRNA增量可被3MA作用所逆转。5.使用羟基氯喹HCQ刺激，发现明显增加细胞自噬分子蛋白质LC3B及自噬溶酶体的表达。与此同时，HCQ发现可浓度依赖性降低HSC-T6中Ⅰ型前胶原mRNA的表达并浓度依赖性抑制HSC-T6增殖。有趣的是，HCQ作用下HSCⅠ型前胶原mRNA的表达水平与细胞的增殖抑制率呈负相关关系，P=0.02，相关系数r=-0.882。6.用Western blot检测不同阶段的肝纤维化大鼠模型肝脏组织，发现随着四氯化碳注射诱导时间的延长，肝组织中Atg5、beclin-1的表达上升。7.同时将HCQ、3MA与HSC共孵育24h后，发现联合用药比单药的致细胞调亡率更明显，P＜0.05。结论：1.本研究确认肝星状细胞存在自噬现象；2.自噬水平的调节可影响肝星状细胞的增殖及前胶原mRNA的表达，抑制自噬可抑制HSC的增殖及前胶原mRNA的表达，提示自噬信号通路为治疗肝纤维化的新靶点；3.羟氯喹明显抑制自噬信号传递，同时显示出显著减少HSCⅠ型前胶原mRNA表达的作用，提示其在抗肝纤维化治疗方面的诱人前景。

论文目录

• 主要中英文缩略语表
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 方法与材料
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述：自噬与肝脏疾病
• 参考文献
• 致谢