抗S.paratyphi AO2抗原单克隆抗体制备及胶体金免疫层析试纸条的研究

论文摘要

甲型副伤寒沙门氏菌是一种在公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病原菌。可以引起腹泻症状或者致死。目前,检测该菌的方法主要包括：传统检测方法、免疫学检测方法、分子生物学检测方法和仪器检测方法。传统检测方法准确,但耗时长,对实验员的操作能力要求较高；分子生物学检测方法灵敏、快速、特异性强,但需要较高的成本和较高的专业技术；仪器检测方法快速,但需要的成本高,另外,也需要比较庞大的数据库,对于一些少见或者新出现的菌无法检测；免疫学检测方法具有快速、操作简便、灵敏等优点因而在致病菌的检测中广泛使用。本研究采用甲型副伤寒沙门氏菌菌体作为免疫抗原,分别制备出抗甲型副伤寒沙门氏菌多克隆抗体和单克隆抗体,另外,在此基础上通过对胶体金、金标抗体和免疫层析的研究,制备疫层析试纸条,为甲型副伤寒沙门氏菌的快速检测提供了基础。本研究的研究内容包括：甲型副伤寒沙门氏菌多克隆抗体的制备：采用标准菌株ATCC50001,甲醛灭活后制备成免疫抗原,成功制备抗甲型副伤寒沙门氏菌多克隆抗体,抗体经过辛酸-硫酸铵法纯化以后,效价为1：25600,纯化后抗体蛋白质浓度为2 mg/mL。采用SDS-PAGE凝胶电泳测得抗体纯度较好,杂带较少,分子量约为132 kD。甲型副伤寒沙门氏菌单克隆抗体的制备：成功制备抗甲型副伤寒沙门氏菌单克隆抗体,抗体经过辛酸-硫酸铵法纯化以后,效价为1：400,纯化后抗体蛋白质浓度为0.3 mg/mL。采用SDS-PAGE凝胶电泳测得抗体纯度较好,杂带较少,分子量约为146 kD。胶体金和金标抗体的制备：本研究选择用柠檬酸钠还原法制备20 nm胶体金溶液,并与40 nm胶体金溶液进行对比。建立了不同柠檬酸钠加入量,紫外吸收峰位置与胶体金粒径大小的关系,实验中优化了结合的蛋白浓度、结合的pH值和缓冲液体系等条件。得到工作条件为：最适蛋白浓度0.36mg/mL;标记最适pH为8.5：缓冲液是pH8.7的硼酸缓冲液；抗体稀释液配方为含1%BSA和5%糖的硼酸缓冲液。成功将20 nm胶体金与单克隆抗体偶联,并能稳定保存。免疫层析试纸条的组装与评测：利用抗甲型副伤寒沙门氏菌的多克隆抗体和单克隆抗体,应用胶体金免疫层析技术制备免疫层析检测试纸条。采用PVC底板、NC膜、玻璃纤维、吸水垫和样品点将免疫层析试纸条组装好。测试得到控制线抗体的最适浓度为1 mg/mL,检测线抗体的最适浓度为1 mg/mL,试纸条的检测限为106cfu/mL,试纸条具有良好的属外特异性,不与其他的菌发生反应,属内与除与伤寒沙门氏菌反应外,属内各群不反应。试纸条能在37℃封闭环境下加速老化30 d后使用正常,常温至少可保存4个月。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 拉丁文
• 第一章 文献综述
• 1.1 沙门氏菌的特征和流行现状
• 1.1.1 沙门氏菌的特征
• 1.1.2 沙门氏菌的流行现状
• 1.2 沙门氏菌检测方法研究现状
• 1.2.1 常规检测技术
• 1.2.2 以免疫学为基础的检测方法
• 1.2.3 分子生物学检测方法
• 1.2.4 仪器检测法
• 1.3 胶体金
• 1.3.1 胶体金简介
• 1.3.2 免疫胶体金的特性
• 1.3.3 免疫胶体金的应用
• 1.4 本研究的目的意义
• 第二章 抗甲型副伤寒沙门氏菌多克隆抗体的制备与纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株来源
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 ELISA试剂的配制
• 2.1.7 蛋白质含量试剂的配制
• 2.1.8 SDS-PAGE缓冲液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 多克隆抗体的制备
• 2.2.2 多克隆抗体的纯化与鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 甲型副伤寒沙门氏菌的形态
• 2.3.2 兔多克隆抗体的产生进程
• 2.3.3 间接ELISA检测兔多克隆抗体的效价
• 2.3.4 兔多克隆抗体蛋白质含量的测定
• 2.3.5 多克隆抗体纯度及分子量的测定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 抗原制备
• 2.4.2 免疫剂量
• 2.4.3 采血
• 2.5 小结
• 第三章 抗甲型副伤寒沙门氏菌单克隆抗体的制备与纯化
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株来源
• 3.1.2 实验细胞
• 3.1.3 实验动物
• 3.1.4 培养液及主要试剂
• 3.1.5 主要仪器
• 3.1.6 细胞融合培养液及主要试剂配制
• 3.1.7 ELISA试剂的配制
• 3.1.8 SDS-PAGE缓冲液的配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 菌株的活化和抗原的制备
• 3.2.2 免疫方案
• 3.2.3 间接ELISA检测小鼠免疫情况
• 3.2.4 SP2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养
• 3.2.5 饲养细胞的制备
• 3.2.6 SP2/0骨髓瘤细胞的制备
• 3.2.7 免疫脾细胞的制备
• 3.2.8 细胞融合
• 3.2.9 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 3.2.10 杂交瘤细胞的克隆化
• 3.2.11 杂交瘤细胞的扩大培养和冻存
• 3.2.12 单克隆抗体的大量制备
• 3.2.13 单克隆抗体的纯化
• 3.2.14 单克隆抗体蛋白含量的测定
• 3.2.15 间接ELISA检测单克隆抗体的效价
• 3.2.16 单克隆抗体纯度及分子量的测定
• 3.2.17 甲型副伤寒沙门氏菌单克隆抗体与多克隆抗体的配对
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 免疫小鼠抗体效价的测定
• 3.3.2 细胞融合与阳性杂交瘤细胞的筛选
• 3.3.3 杂交瘤细胞的克隆化培养与细胞的冻存
• 3.3.4 单克隆抗体大量制备和纯化
• 3.3.5 单克隆抗体的纯化和蛋白含量的测定
• 3.3.6 单克隆抗体纯度及分子量的测定
• 3.3.7 间接ELISA检测单克隆抗体的效价
• 3.3.8 甲型副伤寒沙门氏菌单克隆抗体与多克隆抗体的配对
• 3.4 讨论
• 3.4.1 细胞融合
• 3.4.2 杂交瘤的筛选
• 3.4.3 杂交瘤的克隆化
• 3.5 小结
• 第四章 金标抗体的制备及其稳定配方的选择
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 容器的准备和溶液的配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 胶体金的制备
• 4.2.2 胶体金粒径与加入柠檬酸三钠溶液的对应关系
• 4.2.3 最佳蛋白浓度的确定
• 4.2.4 最佳pH值的确定
• 4.2.5 金标探针复合物的制备
• 4.2.6 胶体金粒径的选择
• 4.2.7 金标抗体稀释液缓冲体系的选择
• 4.2.8 糖对金标抗体稳定性的影响
• 4.3 结果
• 4.3.1 胶体金粒径与加入柠檬酸三钠溶液的对应关系
• 4.3.2 最佳抗体浓度
• 4.3.3 最佳pH值
• 4.3.4 金标抗体偶联后的性质
• 4.3.5 胶体金粒径的选择
• 4.3.6 金标抗体稀释液缓冲体系的选择
• 4.3.7 糖对金标抗体稳定性的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 玻璃仪器和实验用水的处理
• 4.4.2 1%氯金酸的保存
• 4.4.3 胶体金溶液的制备方法
• 4.5 小结
• 第五章 甲型副伤寒沙门氏菌免疫层析试纸条的制备及研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 主要试剂和试纸条材料
• 5.1.2 免疫层析试剂的配制
• 5.2 方法
• 5.2.1 免疫层析试纸条各组分的前处理和制备
• 5.2.2 免疫层析试纸条的组装
• 5.2.3 夹心模式试纸条的判定标准
• 5.2.4 控制线抗体浓度的选择
• 5.2.5 检测线抗体浓度的选择
• 5.2.6 试纸条的检测限
• 5.2.7 试纸条的特异性
• 5.2.8 试纸条的稳定性
• 5.3 结果
• 5.3.1 控制线抗体浓度的选择
• 5.3.2 检测线抗体浓度的选择
• 5.3.3 试纸条检测限的确定
• 5.3.4 试纸条的特异性
• 5.3.5 试纸条的稳定性
• 5.4 讨论
• 5.4.1 试纸条的稳定性
• 5.4.2 NC膜的选择
• 5.5 小结
• 第六章 结论
• 6.1 研究总结
• 6.2 创新
• 6.3 研究展望
• 参考文献
• 致谢