论文摘要
目的:本文旨在研究盐酸川芎嗪对B16F10黑色素瘤转移的影响,并深入探讨其影响B16F10黑色素瘤转移的分子机理。方法:1.建立B16F10黑色素瘤（C57BL/6小鼠）自发性转移模型,将小鼠随机分成模型组、盐酸川芎嗪低,中,高剂量组分别腹腔注射给予生理盐水、盐酸川芎嗪6.7,20,60mg/kg/day连续给药46天。接种肿瘤细胞23天后切除荷瘤足部,10%福尔马林固定再用免疫组化法测定肿瘤组织内CD34、VEGF、MMP2、MMP9等细胞因子的表达并观察肿瘤血管生成情况;给药46天后处死动物取肺,称量肺重并计算肺表面的转移结节数,然后用10%福尔马林固定,并用HE染色法分析肺部血管生成情况来评价其抗肿瘤转移作用效果;采用Western-blot法测定盐酸川芎嗪对B16F10细胞分泌的MMP2,MMP9,VEGF等细胞因子表达的影响,从细胞因子角度来深入探讨盐酸川芎嗪影响B16F10黑色素瘤转移的潜在机制。2.采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、迁移及小管形成等体外血管生成实验模型研究盐酸川芎嗪对体外血管生成的影响;采用鸡胚绒毛尿囊膜和基质胶栓（Matrigel Plug）等体内血管生成实验模型来研究川芎嗪对体内血管生成的影响;从体内和体外两方面来评价盐酸川芎嗪对血管生成的影响。结果:1.B16F10黑色素瘤自发性转移模型结果表明盐酸川芎嗪（6.7mg/kg/day,20mg/kg/day,60mg/kg/day）组的肿瘤结节数与对照组相比明显减少,且差异有显著性（P＜0.05）,但盐酸川芎嗪对小鼠的肺重无明显影响（P＞0.05）;盐酸川芎嗪能降低肿瘤组织内的CD34,VEGF,MMP2,MMP9等因子的表达;HE染色分析结果显示盐酸川芎嗪组肺部血管数随着剂量增大呈逐步减少趋势。蛋白印迹实验结果表明盐酸川芎嗪（1μg/ml,10μg/ml,100μg/ml）作用于B16F10细胞后,其蛋白中的MMP2,MMP9和VEGF等细胞因子的表达有下降趋势。2.盐酸川芎嗪（0.16μg/ml,0.8μg/ml,4μg/ml,20μg/ml,100μg/ml）对HUVECs增殖的抑制率与对照组相比较无明显差异（P＞0.05）;HUVECs迁移实验结果表明盐酸川芎嗪（0.8μg/ml,4μg/ml,20μg/ml,100μg/ml）作用于VEGF诱导的HUVECs后随着药物浓度加大细胞的运动能力减弱细胞迁移到下室的数量明显减少,与VEGF组比较差异有显著性（P＜0.05）;HUVECs小管形成实验结果表明盐酸川芎嗪（0.8μg/ml,4μg/ml,20μg/ml,100μg/ml）作用于VEGF诱导的HUVECs后细胞分化能力减弱,随着药物浓度增大小管形成数逐渐减少,与VEGF组小管数明显减少（P＜0.05）;大鼠主动脉环血管生成实验结果显示,盐酸川芎嗪（20gg/ml,100μg/ml）作用于VEGF诱导的大鼠动脉环后,动脉环周围形成微血管数量随着药物浓度增大逐步减少,血管形成数与VEGF组相比明显减少,且差异有显著性（P＜0.05）。3.体内基质胶栓（Matrigel plug）实验结果表明空白组胶栓颜色为深红色,而注射给予盐酸川芎嗪（20mg/kg,40mg/kg）后胶栓颜色为浅红色,且测得盐酸川芎嗪组基质胶栓中血红蛋白含量与对照组相比明显减少（P＜0.01）;鸡胚绒毛尿囊膜实验中给药后载体周围血管支点数比VEGF组血管支点数明显减少（P＜0.05）。结论:盐酸川芎嗪对B16F10黑色素瘤转移有良好的抑制作用,但对转移灶本身的生长增殖并无明显作用;通过一系列体外和体内血管生成实验模型的使用,发现盐酸川芎嗪对血管生成有很好的抑制作用。因此,推测其抑制肿瘤转移的作用机制可能主要与抗肿瘤血管生成有关。