镉致体外培养鸡胚脑神经元凋亡机理的研究

论文摘要

本试验以体外培养鸡胚脑神经元为研究对象,在培养液中加入不同浓度CdCl2,通过对神经元活性检测、形态学观察、细胞凋亡、抗氧化功能、DNA损伤、Δψm、细胞内游离钙离子浓度、Caspase-3,9活性及细胞内CaM、Caspase-3mRNA表达水平等的检测,探讨了镉致鸡胚脑神经元凋亡的机理。研究结果表明:1.选用7 d龄鸡胚分离脑神经细胞,采用四唑盐比色法（MTT法）和二硝基苯肼比色法观察CdCl2对鸡胚脑神经元活性的影响,结果表明CdCl2对鸡胚脑神经元具有毒性作用。2.采用流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸（PS）,AO/EB双荧光染色、HE染色、透射电镜观察镉致鸡胚脑神经元形态学变化、琼脂糖凝胶电泳、TUNEL法观察不同浓度CdCl2诱导鸡胚脑神经元凋亡情况,从不同角度证实CdCl2能够引发神经元凋亡。3.通过对细胞内抗氧化功能的检测,结果表明镉能够导致神经元NOS活性与NO含量升高,ROS含量增高,表明CdCl2能够破坏机体抗氧化防御系统及清除自由基功能,使鸡胚脑神经元发生氧化损伤,进而诱导其发生凋亡。4.应用碱性SCGE检测镉对鸡胚脑神经元DNA的损伤作用,结果证实CdCl2通过引起神经元内游离Ca2+浓度增加,激活内源性核酸内切酶导致DNA在核小体间断裂途径诱导神经元凋亡。5.应用流式细胞术检测Δψm,比色法检测Caspase-3,Caspase-9活性,荧光探针法检测鸡胚脑神经元内游离钙离子浓度,半定量RT-PCR法检测了神经元内Caspase-3 mRNA、CaM mRNA表达水平。试验表明CdCl2导致鸡胚脑神经元游离钙离子浓度升高,干扰细胞钙离子的转运,导致细胞钙稳态失衡,使Δψm下降,Caspase-3,9活性上升,进而通过激活线粒体凋亡通路导致神经元凋亡。本试验从细胞、分子水平上探讨镉致禽类脑神经元性作用,揭示了镉能够降低神经元的活性、诱发氧化应激、损伤细胞DNA、干扰细胞钙稳态、影响细胞内基因表达、诱导细胞凋亡,阐明了镉致禽类脑神经元毒性机制,为畜禽镉中毒的防治提供了理论依据,丰富了毒理学和比较医学的资料,对保护畜牧业的健康发展,保护野生禽类,维持生态平衡具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 镉对中枢神经系统的毒性作用
• 1.2 镉与细胞凋亡
• 1.2.1 镉与线粒体
• 1.2.2 镉与钙离子
• 1.2.3 镉与DNA 损伤
• 1.3 CASPASE 与细胞凋亡
• 1.4 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器与材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试验药品
• 2.2 鸡胚脑神经元培养及处理
• 2.3 检测项目与方法
• 2.3.1 鸡胚脑神经元的鉴定
• 2.3.2 镉对鸡胚脑神经元活性影响的检测
• 2.3.3 镉对鸡胚脑神经元细胞凋亡的检测
• 2.3.4 镉致鸡胚脑神经元DNA 损伤的检测
• 2.3.5 镉对鸡胚脑神经元氧化损伤的检测
• 2+]i 浓度影响的检测'>2.3.6 镉对鸡胚脑神经元内[Ca²⁺]i 浓度影响的检测
• 2.3.7 流式细胞术检测细胞线粒体膜电位
• 2.3.8 Caspase-3、9 蛋白活性的检测
• 2.3.9 半定量RT-PCR 法测定脑神经元内CaM、Caspase-3 mRNA 的表达
• 2.4 数据分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 镉对鸡胚脑神经元活性影响的检测结果
• 3.1.1 MTT 比色法检测结果
• 3.1.2 LDH 活性的检测结果
• 3.2 镉诱导鸡胚脑神经元凋亡的检测结果
• 3.2.1 镉致鸡胚脑神经元凋亡的形态学检测结果
• 3.2.2 镉致鸡胚脑神经元凋亡检测结果
• 3.3 镉致鸡胚脑神经元DNA 损伤的检测结果
• 3.4 镉对鸡胚脑神经元NO 代谢影响的检测结果
• 3.4.1 镉对鸡胚脑神经元内NO 含量影响的检测结果
• 3.4.2 镉对鸡胚脑神经元内NOS 活性影响的检测结果
• 3.5 镉对鸡胚脑神经元内ROS 含量影响的检测结果
• 3.6 镉致鸡胚脑神经元ΔΨM 变化的检测结果
• 3.7 镉对鸡胚脑神经元PS 影响的检测结果
• 3.8 镉对鸡胚脑神经元CASPASE-3，9 活性影响的检测结果
• 2+]I 影响的检测结果'>3.9 镉对鸡胚脑神经元内[CA²⁺]I 影响的检测结果
• 3.10 镉对鸡胚脑神经元内Β-ACTIN、CASPASE-3、CAM MRNA表达影响的检测结果
• 3.10.1 鸡胚脑神经元内β-actin、Caspase-3、CaM基因片段RT-PCR产物的鉴定结果
• 3.10.2 镉对鸡胚脑神经元内Caspase-3、CaM mRNA 表达影响的检测结果
• 4. 讨论
• 4.1 鸡胚脑神经元分离、培养与鉴定
• 4.2 镉对鸡胚脑神经元活性的影响
• 4.2.1 镉对鸡胚脑神经元抑制率的影响
• 4.2.2 镉对鸡胚脑神经元培养上清液中LDH 活性的影响
• 4.3 镉对鸡胚脑神经元凋亡的影响
• 4.3.1 镉对鸡胚脑神经元形态学的影响
• 4.3.2 镉对鸡胚脑神经元磷脂酰丝氨酸的影响
• 4.3.3 琼脂糖凝胶电泳法和TUNEL 法检测镉对鸡胚脑神经元凋亡的影响
• 4.4 SCGE 检测镉对鸡胚脑神经元DNA 损伤的影响
• 4.5 镉对鸡胚脑神经元氧化损伤的影响
• 4.5.1 镉对鸡胚脑神经元内NO 代谢和NOS 活性的影响
• 4.5.2 镉对鸡胚脑神经元内ROS 代谢的影响
• 2+]I 和CAMMRNA 表达影响的研究'>4.6 镉致鸡胚脑神经元内[CA²⁺]I 和CAMMRNA 表达影响的研究
• 4.7 镉诱导鸡胚脑神经元细胞内线粒体膜电位改变的研究
• 4.8 镉对鸡胚脑神经元内CASPASE-3、9 蛋白活性及CASPASE-3 MRNA 表达的影响
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文