灵芝羊毛甾醇合酶基因的克隆及其表达特性研究

论文摘要

灵芝（Ganoderma lucidum）在我国有着悠久的使用历史,可用于调理和治疗多种疾病。灵芝的主要药效成分之一是三萜类化合物,具有抗肿瘤作用、抑制组织胺释放作用、抗HIV和HIV蛋白酶及抑制胆固醇的合成和吸收等作用。所以,三萜类化合物的含量已成为评定灵芝药用价值的重要指标。三萜作为次级代谢产物,是通过甲羟戊酸（MVA）途径,经过法呢酯焦磷酸、鲨烯、鲨烯-2,3-氧化物和羊毛甾醇等中间体,最后经过一系列氧化还原以及环化反应形成的。羊毛甾醇合酶（LS）处于甲羟戊酸（MVA）途径中的第二个分支点,是萜类化合物合成过程中的一个关键酶,它可以催化2,3-氧化鲨烯环化生成羊毛甾醇。LS的含量以及活性高低会影响到三萜类化合物的产量。根据已经公布的其它物种LS蛋白质序列保守区,设计一对简并引物,以灵芝基因组DNA作为模板,经过简并引物PCR扩增,一个488bp的灵芝LS基因特异DNA片段被得到。利用获得的基因特异片段,设计三条特异的引物,采用SEFA PCR方法,扩增获得LS基因的5′端基因组DNA序列。以灵芝原基为材料制备cDNA,使用此cDNA作为模板,通过3’-RACE,得到了LS基因的3′端cDNA序列。根据PCR扩增得到的序列设计特异引物进行扩增,获得了LS基因的全长cDNA序列。该序列长度为2181 bp,编码726个氨基酸。根据获得的序列信息进行拼接获得了LS的全长基因组（genomic DNA）序列。该序列全长为2924 bp,LS基因由7个外显子和6个内含子构成。氨基酸序列经Blast比对发现,灵芝LS与担子菌新型隐球菌Cryptococcus neoformans显示出最高相似性（53%）,这符合灵芝的经典分类。将灵芝LS基因cDNA序列插入到酵母表达载体pYES2中,转入由于缺失LS活性而依赖麦角甾醇（ergosterol）才能生存的酵母突变株osc△。结果显示转化子能够在28℃、不添加麦角甾醇（ergosterol）的培养基上生长,而缺陷型单倍体不能生长,证实了所获得的LS基因是有功能的。根据灵芝LS基因组序列设计一对引物,以灵芝基因组DNA（genomic DNA）为模板,扩增得到了LS基因启动子序列,此序列长度为767bp,用PlantCARE对LS启动子序列进行预测,结果显示LS基因启动子中存在TATA-box和CAAT-box,同时还有多个响应光、激素ABA和环境压力等因子的顺式作用元件。通过real-time PCR的方法,对灵芝不同发育阶段中LS的转录本差异进行了检测。结果表明,在灵芝原基时期,LS的转录本数量要显著高于菌丝体中的转录本数量。这种规律与Hirotani等人所报道三萜含量的变化规律相同。在培养基中添加信号物质茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）,可以显著地诱导灵芝三萜的合成。因此,用不同浓度MeJA处理菌丝体后对其中LS基因转录本进行了检测。100-200μM MeJA作用下,LS基因的转录本显示出连续性增加,最佳诱导浓度是200μM。同时,启动子活性分析实验表明在灵芝LS基因的启动子中至少存在一个潜在的茉莉酸甲酯响应元件,上述结果表明,灵芝LS很有可能是通过MeJA响应元件参与了由MeJA介导的三萜生物合成。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 一、灵芝药用成分功能及研究进展
• 1 灵芝三萜药理作用研究
• 2 灵芝多糖的药理作用研究进展
• 二、灵芝分子生物学研究
• 1 灵芝分类学研究
• 2 灵芝转化系统研究
• 3 灵芝基因克隆方面的进展
• 三、羊毛甾醇合酶的研究进展
• 1 Lanosterol synthase在甲羟戊酸途径中的作用
• 2 Lanosterol synthase催化反应机理
• 3 Lanosterol synthase的结构特征
• 4 Lanosterol synthase的克隆
• 5 目前国际上关于OSC研究的主要方向
• 四、研究意义
• 第二章 灵芝羊毛甾醇合酶基因的克隆及其功能验证
• 第一节 灵芝羊毛甾醇合酶基因的克隆
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果与讨论
• 第二节 灵芝羊毛甾醇合酶基因的功能验证
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 第三章 灵芝羊毛甾醇合酶基因表达特性的研究
• 第一节 Real-time PCR检测灵芝LS基因在菌丝不同发育阶段以及不同浓度茉莉酸甲酯处理下的表达特性
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果与讨论
• 第二节 GUS荧光测定法检测茉莉酸甲酯对LS基因启动子活性的影响
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录