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重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子发酵工艺和液相色谱法对其复性并同时纯化

2020-11-22阅读(611)

重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子发酵工艺和液相色谱法对其复性并同时纯化

论文摘要

液相色谱（LC）对变性蛋白复性是近年来迅速发展起来的一种新的方法,它能够显著地提高蛋白复性效率,并同时使蛋白得到纯化,目前已成为国际上的研究热点。本论文先对大肠杆菌（E. coli）表达的rhGM-CSF进行了发酵工艺和放大工艺的研究和优化,得到高表达、高产量的包涵体,然后分别用疏水色谱（HPHIC）、离子交换色谱（HPIEC）、排阻色谱（SEC）对rhGM-CSF进行了复性并同时纯化。 论文包括以下五个部分: 1.前言 简要的介绍了蛋白质复性的意义,对近年来发展起来的蛋白质复性新方法进行了系统地综述。对rhGM-CSF的复性及分离纯化研究进展进行了评述。引用文献99篇。 2.rhGM-CSF摇瓶发酵工艺和放大工艺的研究 通过摇瓶发酵对大肠杆菌DH5α/pDH生产rhGM-CSF的培养基、培养温度、诱导时机、诱导维持时间、接种量等进行了研究,选择了较好的摇瓶培养条件。结果表明,大肠杆菌适宜在32℃进行培养,在对数生长前期升温至42℃诱导4～5小时,可获得较高的表达量rhGM-CSF。同时进行了发酵工艺的放大研究。 3.HPHIC对rhGM-CSF复性并同时纯化 成功应用高效疏水色谱（HPHIC）对E. coli表达的rhGM-CSF进行了复性和纯化,研究了固定相、盐种类、流动相pH、流动相中脲浓度,GSH/GSSG比例等因素对rhGM-CSF复性和纯化的影响。在优化条件下,经一步HPHIC可以得到比活为1.58×107IU/mg,纯度为95.7%,质量回收率为56.8%的rhGM-CSF。 4.HPIEC对rhGM-CSF复性并同时纯化 采用HPIEC法成功对7.0mol/L盐酸胍变性的rhGM-CSF进行了复性并同时纯化,考察了流动相pH、流动相中脲浓度、GSH/GSSG比例等因素对rhGM-CSF复性的影响。结果表明,GSSG/GSH可有效提高rhGM-CSF二硫键的正确对接和复性效率,而低浓度的脲则可有效抑制蛋白沉淀,可大大提高质量回收率。在最优化条件下,HPIEC一步可使rhGM-CSF在分离纯化的同时进行复性,其比活为

论文目录

  • 第一章 前言
  • 1.1 蛋白质复性的意义
  • 1.2 蛋白质复性技术
  • 1.2.1 稀释复性
  • 1.2.2 辅助因子和添加复性技术
  • 1.2.3 固定化辅助因子复性
  • 1.3 蛋白质的液相色谱法复性
  • 1.3.1 HIC
  • 1.3.2 SEC
  • 1.3.3 IEC
  • 1.3.4 AFC
  • 1.4 二硫键的正确对接
  • 1.5 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）概述
  • 1.5.1 hGM-CSF基因的克隆和表达
  • 1.5.2 包涵体的处理
  • 1.5.3 rhGM-CSF的复性
  • 1.5.4 rhGM-CSF的纯化
  • 参考文献
  • 第二章 大肠杆菌生产rhGM-CSF摇瓶发酵工艺和放大工艺研究
  • 2.1 前言
  • 2.2 实验部分
  • 2.2.1 仪器与试剂
  • 2.2.2 菌株与主要试剂
  • 2.2.3 实验方法
  • 2.3 结果分析
  • 2.4 结果与讨论
  • 2.4.1 培养基种类对rhGM-CSF表达的影响
  • 2.4.2 培养温度对E． coli生长的影响
  • 2.4.3 诱导时机对E． coli生长和rhGM-CSF表达的影响
  • 2.4.4 诱导维持时间对E． coli生长和rhGM-CSF表达的影响
  • 2.4.5 接种量对E． coli生长和rhGM-CSF表达的影响
  • 2.4.6 优化条件下大肠杆菌DH5α/PDH/rh GM-CSF的培养
  • 2.4.7 rhGM-CSF发酵的放大
  • 2.5 结论
  • 参考文献
  • 第三章 疏水色谱法对rhGM-CSF的复性并同时纯化
  • 3.1 引言
  • 3.2 理论部分
  • 3.3 实验部分
  • 3.3.1 仪器和设备
  • 3.3.2 主要试剂
  • 3.4 结果与讨论
  • 3.4.1 用HPHIC色谱饼复性并同时纯化rhGM-CSF
  • 3.4.2 固定相的影响
  • 3.4.3 盐种类的影响
  • 3.4.4 流动相pH值的影响
  • 3.4.5 流动相中GSH/GSSG的比例对rhGM-CSF复性和纯化的影响
  • 3.4.6 流动相中脲浓度对rhGM-CSF复性和纯化的影响
  • 3.4.7 HPHIC与稀释法的比较
  • 3.4.8 rhGM-CSF的纯度和质量回收率
  • 3.4.9 HPHIC复性过程中rhGM-CSF的质量损失
  • 3.5 结论
  • 参考文献
  • 第四章 离子交换色谱法对rhGM-CSF的复性并同时纯化
  • 4.1 引言
  • 4.2 复性原理
  • 4.3 实验部分
  • 4.3.1 仪器
  • 4.3.2 试剂
  • 4.3.3 rhGM-CSF包涵体的洗涤、破碎、抽提
  • 4.3 4 Bradford法测定蛋白含量
  • 4.3.5 rh GM-CSF活性的测定
  • 4.3.6 离子交换色谱法对rhGM-CSF粗提物的复性和纯化
  • 4.3.7 稀释法
  • 4.4 结果与讨论
  • 4.4.1 HPIEC对rhGM-CSF包涵体提取液的分离纯化
  • 4.4.2 流动相pH值的影响
  • 4.4.3 流动相中GSH/GSSG对rhGM-CSF复性和纯化的影响
  • 4.4.4 流动相中不同脲浓度对rhGM-CSF复性和纯化的影响
  • 4.4.5 HPIEC与稀释法的比较
  • 4.4.6 rh GM-CSF的纯度和质量回收率
  • 4.5 结论
  • 参考文献
  • 第五章 排阻色谱法对rhGM-CSF的复性并同时纯化
  • 5.1 前言
  • 5.2 理论部分
  • 5.2.1 普通排阻色谱复性
  • 5.2.2 脲梯度排阻色谱复性
  • 5.3 实验部分
  • 5.3.1 仪器和材料
  • 5.3.2 主要试剂
  • 5.3.3 rhGM-CSF包涵体的洗涤、破碎、抽提
  • 5.3.4 Bradford法测定蛋白含量
  • 5.3.5 rhGM-CSF活性的测定
  • 5.3.6 用普通SEC复性rhGM-CSF
  • 5.3.7 用脲梯度SEC复性rhGM-CSF
  • 5.4 结果与讨论
  • 5.4.1 脲浓度对rhGM-CSF复性的影响
  • 5.4.2 流动相pH对rhGM-CSF复性的影响
  • 5.4.3 流动相流速对rhGM-CSF复性影响
  • 5.4.4 GSH/GSSG比例对rhGM-CSF复性的影响
  • 5.4.5 rhGM-CSF纯度和质量回收率
  • 5.4.6 脲梯度SEC复性rhGM-CSF
  • 5.5 结论
  • 参考文献
  • 致谢

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