紫杉烷类化合物和微管蛋白相互作用模型的建立及其在肿瘤耐药和阿尔茨海默氏症研究中的应用

论文摘要

紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）是一种广泛用于肿瘤化疗的有丝分裂抑制剂,目前成功地用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌、卡波氏肉瘤等多种恶性肿瘤的治疗。紫杉醇的作用机理是通过和微管蛋白结合,诱导和稳定微管蛋白聚合成微管并抑制其解聚,使微管不能与微管组织中心相互连接,细胞周期停滞于G2/M期,最终导致有丝分裂异常或者停止,使癌细胞无法继续分裂凋亡紫杉醇和其靶点微管蛋白的相互作用研究对于人们深入的理解其作用机制,并利用该机制进行紫杉烷类化合物构效关系研究、新型抗耐药紫杉烷类化合物的研究、紫杉烷类化合物新用途的开发等等都有重要的意义。本文致力于构建一系列分子水平的模型来反映紫杉烷类化合物和微管蛋白的相互作用,并将其应用于寻找抗肿瘤耐药和阿尔茨海默病的化合物的研究当中。本文运用两种方法提取纯化得到了高纯度的微管蛋白（W-tubulin）和含有MAPs的微管蛋白——MTP,然后利用紫杉烷类荧光探针的荧光强度和荧光偏振的变化建立了测定微管蛋白和紫杉烷类化合物相互作用的结合常数Kb（Binding constant）的方法,对于高亲和力的化合物,采用HPLC检测的方法测定他们的结合常数,并将结合常数的测定应用于抗肿瘤耐药的化合物和微管蛋白的结合性质评价上。本文还通过荧光物质DAPI作为指示,检测微管蛋白在紫杉烷类化合物的作用下的聚合效应,测得微管聚合的EC50,比传统的浊度法具有更高的灵敏度,该法已用于评价潜在的抗AD药物对微管的稳定作用。此外,还建立了测定微管蛋白聚合的临界浓度的方法和抑制微管聚合化合物的活性评价模型,这些方法将在与微管相互作用的药物研究中发挥重要的作用。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 主要实验材料
• 实验方法
• 1. 微管蛋白的提取与纯化
• 1.1 修饰的Weisenberg法提纯高纯度微管蛋白
• 1.2 两次循环聚合/解聚法提纯含MAPs的微管蛋白MTP
• 1.3 SDS-PAGE测定微管蛋白纯度
• 1.4 紫外分光光度法测定微管蛋白的浓度
• 2. 紫杉烷类化合物和微管蛋白结合模型的建立
• 2.1 基于荧光强度的变化测定紫杉烷类化合物和微管蛋白的结合
• 2.2 基于荧光偏振原理测定紫杉烷类化合物和微管蛋白的结合
• 2.3 利用HPLC测定和微管具有高亲和力的紫杉烷类化合物的结合
• 3. 荧光分光光度法测定紫杉烷类化合物促进微管聚合的临界浓度
• 4. 紫杉烷类化合物促进微管聚合模型的建立
• 5. 荧光法测定抑制微管聚合化合物的动力学效果
• 实验结果
• 1. 微管蛋白的提取与纯化
• 1.1 修饰的Weisenberg法提纯不含MAPs的微管蛋白
• 1.2 两次循环聚合解聚法提纯含MAPs的微管蛋白MTP
• 2. 紫杉烷类化合物和微管蛋白的结合
• 2.1 基于荧光强度变化测定紫杉烷类化合物和微管蛋白的结合
• 2.2 基于荧光偏振原理测定紫杉烷类化合物和微管蛋白的结合
• 2.3 利用HPLC检测与微管具有高亲和力的紫杉烷类化合物的结合
• 3. 化合物对微管蛋白的作用效果
• 3.1 荧光分光光度法测定紫杉烷类化合物促进微管聚合的临界浓度
• 3.2 紫杉烷类化合物促进微管聚合模型的建立
• 3.3 荧光法测定抑制微管聚合化合物的微管动力学效果
• 讨论
• 1. 微管蛋白的提取与纯化
• 2. 紫杉烷类化合物和微管蛋白的结合
• 3. 化合物对微管蛋白的作用效果
• 3.1 荧光分光光度法测定紫杉烷类化合物促进微管聚合的临界浓度
• 3.2 紫杉烷类化合物促进微管聚合模型的建立与应用
• 3.3 荧光法测定抑制微管聚合化合物的动力学效果
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢