原子力显微镜和光镊技术对红细胞生物物理特性的研究

论文摘要

新型的光电仪器以激光作为精密传感器的光源,这为生命科学和生物物理学的应用研究开辟了一个新的途径,形成了一些研究生命科学问题的生物物理新技术、新方法。原子力显微镜是目前在高分辨率条件下对活细胞实时成像并测量分析的单分子技术之一。它是利用一束低功率激光聚焦到灵敏的弹性微悬臂上,通过其正下方的尖锐探针尖在待测样品上进行光栅式扫描,探针尖与样品间产生相互作用力,光电探测器接受探针偏移量对应的反射激光光强差来获取样品表面形貌学信息。改变三维压电扫描器运动方式,探针和样品间会因距离变化的而相互施加作用力,产生力-距离图谱曲线,通过收集样品表面上作用力图谱信息来研究样品的生物物理特性。激光光镊是利用激光与物质间进行动量传递时的力学效应而形成的三维光学势阱。它能够捕获和操控纳米尺度范围的微观粒子。光镊传感器能够进行捕获、悬浮、分选、融合、切割和装配等多种操作,定量地研究分子间动态和静态的力学特性,定性地表征生物个体的生命过程。光镊作为无探测硬伤、远距离操作的微探针,对环境扰动小,生物微粒的内外结构均能实现实时探测和活体操控。作为新型光电精密测控技术,原子力显微镜与激光光镊是当前生物物理学新技术与新方法的应用研究热点,有着潜在的科学前瞻性和广泛的应用前景。本课题研究内容包括以下三个方面:1.红细胞膜弹性特性的AFM力曲线测量。人血红细胞生存环境的微小变化都会直接影响到膜骨架蛋白网络形变和细胞膜弹性力学性能的改变。利用原子力显微镜力曲线测量红细胞膜表面弹性,根据相关力-距离曲线图谱信息,分析活性红细胞在不同生理溶液环境中细胞膜弹性、粘附性与渗透脆性等变化特征。实验研究表明红细胞膜弹性特性和膜骨架形变都与生理环境中的溶质（糖类与晶体电解质等）、浓度和渗透压等因素有直接关系。这为深入了解生物膜结构和动力学提供机会,也为AFM应用于红细胞膜病的临床诊断提供依据。2.红细胞形态及活性随pH值变化的AFM观测分析。利用原子力显微镜技术对自体血浆环境中活性红细胞随pH变化的微观形态学特性进行观测研究,用紫外分光光谱扫描技术对胞内血红蛋白分子的特征吸收峰和吸收光谱进行检测分析。实验研究表明,红细胞弹性形变、细胞膜液晶态相变,胞内血红蛋白分子构型改变,膜骨架网络重新组装或解旋、以及膜表面电荷密度重新分配等复杂的生理调控过程与自体血浆环境中pH值的轻微波动直接相关,可能造成了不同pH条件中活性红细胞携氧能力显著不同。这为研究特殊pH值环境中外周组织器官对红细胞及其血液微观流变学的生理依赖关系提供理论和实验依据。3.光镊结合AFM对活态红细胞生存环境的研究。利用激光单光镊对血浆生理环境下人血活态红细胞进行捕获、夹持、牵引和定位,结合原子力显微镜和环境扫描电镜技术对红细胞微观形态学特性进行观测研究。实验研究显示,在血浆生理环境中不同温度孵育的红细胞经原子力显微镜观测,其膜表面微观结构对温度变化比较灵敏,液晶态生物膜被扰动而发生轻微相变;在光镊捕获实验中,三维激光势阱囚禁的红细胞却仍能够维持良好生理特性和完好形态,并且细胞膜表面存在相互作用力。研究结果表明,基于光压原理研制的光镊不仅能够捕获和操纵微米尺度活态生物微粒;而且,其灵活无损的操控方式和动态实时观测模式,对原子力显微镜技术应用于最佳生理环境下观测活态红细胞的研究提供了独特而且有效的辅助手段。这篇论文对于理解活态红细胞的生物物理特性分别采用原子力显微镜和光镊技术,为其提供了互补性的实验数据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 红细胞
• 1.1.1 红细胞弹性及其形变特征
• 1.1.2 红细胞膜骨架蛋白的理论模型
• 1.1.3 红细胞的研究意义
• 1.2 原子力显微镜
• 1.2.1 原子力显微镜的原理
• 1.2.2 原子力显微镜的成像模式
• 1.2.3 力-距离曲线原理
• 1.2.4 原子力显微镜在生物物理学中的应用
• 1.3 光镊
• 1.3.1 光镊原理
• 1.3.2 光镊特点及其优越性
• 1.3.3 光镊技术在生物物理学中的应用
• 第2章 红细胞膜弹性特性的AFM力曲线测量
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂与仪器
• 2.1.2 生理缓冲液制备
• 2.1.3 红细胞制备
• 2.1.4 AFM观测样品的制备
• 2.1.5 AFM力曲线测量红细胞膜弹性特性的实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 AFM观测生理血浆缓冲液中的活性红细胞微观结构
• 2.2.2 力曲线测定经生理盐水制备的活性红细胞膜弹性
• 2.2.3 力曲线测定经5%生理葡萄糖溶液制备的红细胞膜弹性
• 2.2.4 力曲线测定经生理血浆溶液制备的红细胞膜弹性
• 2+/Mg²⁺的D-PBS缓冲液制备的活性红细胞'>2.2.5 等渗无Ca²⁺/Mg²⁺的D-PBS缓冲液制备的活性红细胞
• +浓度变化对红细胞膜弹性特性的影响'>2.2.6 K⁺浓度变化对红细胞膜弹性特性的影响
• +浓度变化对红细胞膜弹性特性的影响'>2.2.7 Na⁺浓度变化对红细胞膜弹性特性的影响
• 2.3 讨论
• 第3章 红细胞形态及活性随pH值变化的AFM观测分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂与仪器
• 3.1.2 等渗PBS生理缓冲液制备
• 3.1.3 在70%自体血浆环境中红细胞悬浮液的制备
• 3.1.4 AFM观测样品的制备
• 3.1.5 紫外分光光度计检测红细胞内血红蛋白分子的吸收光谱
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 pH值对活态红细胞的微观形态学影响的AFM测量
• 3.2.2 pH值为7.2～7.6时红细胞微观形貌学的AFM测量与分析
• 3.2.3 pH值<7.2时活态红细胞微观形态学的AFM测量与分析
• 7.6时红细胞的形态及微观形貌'>3.2.4 pH值>7.6时红细胞的形态及微观形貌
• 3.2.5 pH值对红细胞内血红蛋白Hb吸收光谱的影响
• 3.3 结论
• 第4章 光镊结合AFM对活态红细胞生存环境的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂与仪器
• 4.1.2 等渗PBS生理缓冲液制备
• 4.1.3 血浆环境中红细胞悬浮液的制备
• 4.1.4 AFM观测样品的制备
• 4.1.5 电镜观测样品的制备
• 4.1.6 光镊观测样品的制备
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 温度对血浆环境中红细胞膜微观结构形态影响的AFM检测
• 4.2.2 电镜观测血浆环境中制备的红细胞
• 4.2.3 光镊操控血浆环境中活态红细胞
• 4.3 结论
• 第5章 总结与展望
• 5.1 论文总结
• 5.2 论文中仍存在的主要疑问
• 5.3 工作展望
• 论文的创新性
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果