少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）捕食线虫生化机制研究

论文摘要

寄生虫病特别是寄生性线虫病目前依然是严重危害畜牧业发展的大敌。对这类病原生物的防治主要依靠抗蠕虫化学药物,但化学驱虫药物不可避免地产生了抗药性、药物残留和生态环境污染三个方面的问题。为了解决化学驱虫药物防治家畜寄生性线虫病所带来的上述弊端,促进畜牧业的可持续发展,需要寻求新的家畜线虫病防治方法。目前,研究最多、最深入且最有应用前景的就是利用寄生性线虫的自然天敌-捕食线虫性真菌进行生物防治。但要想很好达到实际应用捕食线虫性真菌的目的,首先必须弄清这类真菌发挥作用的详细过程和生化机制问题,为此本课题主要进行了以下相关研究:（1）将秀丽新杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为实验动物模型,引入了对捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）捕食过程的观察研究。结果表明:秀丽新杆线虫（Caenorhabditis elegans）在1～2h内即可诱导-少孢节丛孢菌产生捕食器,且最快可于加入虫体后的2h将线虫虫体捕获,捕食器同虫体接触部位的菌丝比未接触处的菌丝粗大,而且表面粗糙似有粘液性物质存在;在捕食性菌环细胞的边缘存在大量大小不均的电子致密体。真菌捕食器同虫体的接触部位多集中在虫体的头部和尾部,表明在这些部位存在某些特异性的作用位点;在线虫和真菌菌环接触部位的表皮有明显的凹陷,说明在捕食的开始阶段机械力的作用确实存在;真菌在穿透线虫体壁后先是形成侵染球,继而再由侵染球发育为菌丝,在此过程中线虫内容物发生降解,菌丝逐渐充满整个虫体内腔,虫体最终崩解消失。（2）通过对捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）生长所需最佳碳源、氮源、碳氮比值及培养基初始pH值的优化,发现在固体培养基上,蔗糖和L-谷氨酸是最好的碳氮源;在pH值为6.8的固体培养基中,对菌丝生长最适合的碳氮比值为5:1;最适合菌丝生长的pH值范围是7.0～8.5。在液体培养基中,玉米粉和硫酸铵对于菌丝生长是最优的碳氮源;对pH值为6.8的液体培养基来说,最佳的碳氮比值为10:1;最适合的pH值范围是5.5～6.0。（3）采用多种氨基酸在固体CMA培养基上对少孢节丛孢菌（A.oligospora）捕食器诱导效力进行了试验,发现加入一定浓度某些种类的氨基酸后,可以诱导少孢节丛孢菌产生捕食器,并能捕食线虫幼虫;并且不同种类氨基酸对少孢节丛孢菌产生捕食器的影响不同,其中以浓度为0.05g/L的L-苯丙氨酸、L-蛋氨酸、DL-缬氨酸的诱导效果较好;L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸属于中等;L-赖氨酸、L-谷氨酸和L-组氨酸溶液表现较差。生长初期和中期加入氨基酸的试验组捕食器产生良好,且前者明显好于后者。说明氨基酸主要刺激新生菌丝产生捕食器。（4）通过分析含捕食器菌丝、普通营养菌丝和寄生性线虫第3期幼虫的生化组分发现:少孢节丛孢菌捕食器（菌环和菌网）粗蛋白质和各种氨基酸的含量大多数都高于分生孢子和普通营养菌丝,但小于线虫幼虫的含量;进一步研究发现含捕食器菌丝中含有一些普通营养菌丝所不具有的蛋白质,且前者的蛋白酶水解活力也明显大于普通营养菌丝;此外,普通营养菌丝总糖的含量为30.69%,高于含捕食器菌丝（菌环和菌网）24.77%的总糖含量。这表明捕食器菌丝的化学组成与普通营养菌丝是不一样的,普通营养菌丝在变成捕食器时,蛋白质、总糖及氨基酸等生化组分的含量均发生了改变。（5）优化了少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物提取的方法,研究了某些化学试剂、酶和蛋白酶抑制剂对真菌生长和捕食作用的影响,初步了解了存在于捕食器表面并参与捕食过程的物质种类及其作用,证实了表面聚合物在黏附线虫时具有重要作用,而且这些物质主要为蛋白质或含蛋白质的化合物;同时还首次在含捕食器菌丝提取到的表面聚合物中,检测到了蛋白酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性,且其活性显著高于普通营养菌丝,间接证实了上述酶类物质可能在捕食过程中起关键作用。（6）通过研究不同诱导剂物质和不同营养组成的液体培养基中培养的少孢节丛孢菌发酵液后,发现培养基的组成成份和相关诱导剂能够显著影响少孢节丛孢菌的代谢过程;而且秀丽新杆线虫刺激产生的培养基滤液和氨基酸刺激产生的培养滤液内所含成分不同;蛋白酶活性越高的滤液中,磷酸酶活性越低。并且从秀丽新杆线虫作刺激物的液体培养基LMZ培养液中纯化到一种丝氨酸蛋白酶,分子量约为38KDa左右,最适pH值范围和最适温度分别为pH6～8.5和50℃。这种丝氨酸蛋白酶的纯化为阐明捕食性真菌对线虫的捕食机理和捕食作用提供了重要资料。（7）扩增并分析了少孢节丛孢菌内蒙古株（A. oligospora CHIM）胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的序列,所得序列全长为1108bp,在片段中含有BstXI、DraII、EcoRI、SacI、SalI和XbaI 6种限制性内切酶酶切位点;少孢节丛孢菌CHIM株丝氨酸蛋白酶基因与同种国外分离株和云南株的同源性分别为80.3%和84.1%;根据核苷酸推导的氨基酸序列同GenBank中发表的相应氨基酸序列的同源性为100%。在线Blastn分析,证实我们扩增所得的片断是少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶编码基因的部分序列。又一次证实捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌存在不同国家、地区株的差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 杀线虫性真菌的分类
• 2 杀线虫性真菌的研究历史
• 3 捕食线虫性真菌对寄主线虫的作用机制
• 3.1 捕食器的形成过程与机理
• 3.2 捕食线虫性真菌对线虫的吸引
• 3.3 捕食线虫性真菌对线虫的识别与黏附
• 3.4 捕食线虫性真菌对线虫的侵染和消解
• 4 杀线虫真菌活性代谢物
• 4.1 杀线虫真菌活性代谢物
• 4.1.1 担子菌及其杀线虫活性代谢物
• 4.1.2 子囊菌及其杀线虫活性代谢物
• 4.1.3 半知菌及其杀线虫活性代谢物
• 4.1.4 无孢菌及其杀线虫活性代谢物
• 4.1.5 接合菌及其杀线虫活性代谢物
• 4.2 产毒真菌活性代谢物研究方向
• 4.2.1 供试线虫的选择
• 4.2.2 筛选的范围扩大
• 4.2.3 低分子量毒素
• 4.2.4 高分子量毒素
• 4.2.5 相关研究进展
• 5 捕食线虫性真菌分子生物学研究
• 5.1 捕食线虫性真菌分子系统学
• 5.2 捕食线虫性真菌相关基因克隆
• 5.2.1 侵染线虫相关基因的克隆
• 5.2.2 捕食器相关基因的克隆
• 6 捕食线虫性真菌在线虫生物防治中的应用模式
• 7 动物寄生性线虫生物控制未来研究方向及本研究的目的和意义
• 第二章 试验研究
• 试验一 少孢节丛孢菌捕食线虫过程的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试验仪器
• 1.1.2 主要化学试剂
• 1.1.3 虫种与菌种来源
• 1.1.4 主要溶液配制
• 1.1.5 主要培养基制备
• 1.2 方法
• 1.2.1 秀丽新杆线虫培养与收集
• 1.2.2 捕食过程染色镜检观察
• 1.2.3 捕食过程组织切片观察
• 1.2.4 捕食过程扫描电镜观察
• 1.2.5 捕食过程透射电镜观察
• 2 结果
• 2.1 普通光镜下少孢节丛孢菌对线虫捕食过程的观察
• 2.2 不同染料染色结果
• 2.3 少孢节丛孢菌捕食线虫组织切片观察结果
• 2.4 少孢节丛孢菌捕食线虫扫描电镜观察结果
• 2.5 少孢节丛孢菌捕食线虫透射电镜观察结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 试验二 不同碳氮源及其比例和培养基初始PH 值对少孢节丛孢菌生长的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要实验设备
• 1.1.2 主要实验药品
• 1.1.3 捕食线虫性真菌菌株
• 1.2 方法
• 1.2.1 不同培养基的制备
• 1.2.2 少孢节丛孢菌转接培养
• 1.2.3 菌丝的接种和培养
• 1.2.4 液体培养基中菌丝的收集和称重
• 1.2.5 数据的处理
• 2 结果
• 2.1 不同碳源对少孢节丛孢菌菌丝生长的影响
• 2.2 不同氮源对少孢节丛孢菌菌丝生长的影响
• 2.3 不同碳氮比值对少孢节丛孢菌菌丝生长的影响
• 2.4 不同初始PH 值对少孢节丛孢菌菌丝生长的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 试验三 氨基酸对少孢节丛孢菌生长和捕食器产生影响研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 溶液配制和线虫幼虫培养
• 1.2.2 氨基酸对少孢节丛孢菌生长率及捕食器产生的影响
• 1.2.3 氨基酸诱导的少孢节丛孢菌捕食器对线虫幼虫的捕食作用
• 2 结果
• 2.1 氨基酸对菌丝生长率及捕食器产生的影响
• 2.1.1 氨基酸对菌丝生长率的影响
• 2.1.2 氨基酸对菌丝生长初期捕食器产生的影响
• 2.1.3 氨基酸对菌丝生长中期捕食器产生的影响
• 2.1.4 氨基酸对菌丝生长后期捕食器产生的影响
• 2.2 不同氨基酸诱导的捕食器对线虫第3 期幼虫的捕食效力
• 3 讨论
• 4 小结
• 试验四 少孢节从孢菌及线虫第三期幼虫生化组分分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要设备与药品
• 1.1.2 主要化学溶液
• 1.1.3 捕食性真菌和线虫第三期幼虫
• 1.2 方法
• 1.2.1 少孢节丛孢菌分生孢子的培养
• 1.2.2 含捕食器菌丝的培养与收集
• 1.2.3 普通营养菌丝的培养与收集
• 1.2.4 少孢节丛孢菌和线虫第三期幼虫粗蛋白质测定
• 1.2.5 少孢节丛孢菌和线虫第三期幼虫氨基酸测定
• 1.2.6 少孢节丛孢菌总糖的测定
• 1.2.7 少孢节丛孢菌总蛋白电泳（SDS-PAGE）
• 1.2.8 少孢节丛孢菌普通营养菌丝和含捕食器菌丝蛋白酶活性测定
• 2 结果
• 2.1 少孢节丛孢菌和第三期线虫幼虫粗蛋白质含量
• 2.2 少孢节丛孢菌和第三期线虫幼虫氨基酸含量
• 2.3 普通营养菌丝和含捕食器菌丝总糖含量
• 2.4 普通营养菌丝和含捕食器菌丝全蛋白质SDS-PAGE 电泳结果
• 2.5 普通营养菌丝和含捕食器菌丝蛋白酶活性测定
• 3 讨论
• 4 小结
• 试验五 少孢节丛孢菌表面聚合物提取及其作用与性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 少孢节丛孢菌表面聚合物的提取
• 1.2.2 少孢节丛孢菌表面聚合物的透析与浓缩
• 1.2.3 少孢节丛孢菌表面聚合物凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 1.2.4 各种提取液对菌丝生长与黏附捕获线虫作用的影响
• 1.2.5 少孢节丛孢菌表面聚合物体外杀线虫活性试验
• 1.2.6 少孢节丛孢菌表面聚合物中蛋白质含量测定
• 1.2.7 少孢节丛孢菌表面聚合物中蛋白酶活性检测
• 1.2.8 PH 值对少孢节丛孢菌表面聚合物中蛋白酶活性的影响
• 1.2.9 温度对少孢节丛孢菌表面聚合物中蛋白酶活性的影响
• 1.2.10 蛋白酶抑制剂对少孢节丛孢菌表面聚合物中蛋白酶活性的影响
• 1.2.11 少孢节丛孢菌表面聚合物中磷酸酶活性的测定
• 1.2.12 纤维素酶和链酶蛋白酶E 对少孢节丛孢菌菌丝生长和捕获线虫作用的影响
• 1.2.13 蛋白酶抑制剂对少孢节丛孢菌生长及黏附捕获和致死线虫能力的影响
• 2 结果
• 2.1 少孢节丛孢菌表面聚合物SDS-PAGE 电泳结果
• 2.2 各种提取液对菌丝生长和捕食器黏附捕获作用的影响
• 2.2.1 提取液对菌丝生长的影响
• 2.2.2 提取液对捕食器黏附捕获作用的影响
• 2.3 少孢节丛孢菌表面聚合物体外杀线虫作用
• 2.4 少孢节丛孢菌表面聚合物蛋白质含量测定结果
• 2.5 少孢节丛孢菌表面聚合物蛋白酶活性检测结果
• 2.6 PH 值对少孢节丛孢菌表面聚合物蛋白酶活性影响结果
• 2.7 温度对少孢节丛孢菌表面聚合物蛋白酶活性影响结果
• 2.8 蛋白酶抑制剂对少孢节丛孢菌表面聚合物中蛋白酶活性影响结果
• 2.9 少孢节丛孢菌表面聚合物磷酸酶活性测定结果
• 2.10 纤维素酶和链酶蛋白酶E 对少孢节丛孢菌生长与捕食作用影响
• 2.10.1 纤维素酶和链酶蛋白酶E 对少孢节丛孢菌生长影响
• 2.10.2 纤维素酶和链酶蛋白酶E 对少孢节丛孢菌黏附捕获线虫作用影响
• 2.11 蛋白酶抑制剂对少孢节丛孢菌生长及黏附捕获线虫能力影响
• 2.11.1 蛋白酶抑制剂对少孢节丛孢菌生长影响
• 2.11.3 蛋白酶抑制剂对少孢节丛孢菌致死线虫作用影响
• 2.11.4 蛋白酶抑制剂处理线虫后对少孢节丛孢菌捕获和致死线虫作用影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 试验六 少孢节丛孢菌胞外蛋白酶的产生与性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 少孢节丛孢菌的培养与胞外蛋白酶的诱导分泌
• 1.2.2 少孢节丛孢菌培养滤液的浓缩处理
• 1.2.3 少孢节丛孢菌培养滤液的杀线虫毒性试验
• 1.2.4 酪蛋白平板消化试验
• 1.2.5 PH 值和温度及蛋白酶抑制剂对胞外蛋白酶活性的影响
• 1.2.6 少孢节丛孢菌培养滤液磷酸酶活性测定
• 1.2.7 少孢节丛孢菌培养滤液蛋白质含量测定
• 1.2.8 少孢节丛孢菌培养滤液SDS-PAGE 凝胶电泳
• 1.2.9 少孢节丛孢菌胞外蛋白酶最佳培养时间确定
• 1.2.10 少孢节丛孢菌培养滤液中胞外蛋白酶纯化
• 1.2.11 胞外蛋白酶纯度检测和分子量测定
• 1.2.12 PH 值和温度及蛋白酶抑制剂对丝氨酸蛋白酶活性影响
• 2 结果
• 2.1 少孢节丛孢菌培养滤液对线虫的毒力试验
• 2.2 少孢节丛孢菌培养滤液蛋白质含量测定结果
• 2.3 酪蛋白平板试验
• 2.4 PH 值对少孢节丛孢菌培养滤液胞外蛋白酶活性影响
• 2.5 温度对少孢节丛孢菌培养滤液胞外蛋白酶活性影响
• 2.6 蛋白酶抑制剂对少孢节丛孢菌培养滤液胞外蛋白酶活性影响
• 2.7 少孢节丛孢菌培养滤液磷酸酶活性测定结果
• 2.8 少孢节丛孢菌培养滤液SDS-PAGE 结果
• 2.9 培养时间对少孢节丛孢菌胞外蛋白酶产量影响
• 2.10 纯化蛋白的纯度及分子量测定
• 2.11 酪蛋白平板消化试验
• 2.12 蛋白酶的最佳作用温度和PH 值
• 2.13 蛋白酶抑制剂对纯化蛋白酶活性影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 试验七 少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因的序列分析与进化研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 少孢节丛孢菌培养
• 1.2.2 基因组DNA 提取
• 1.2.3 DNA 产物纯化
• 1.2.4 基因组DNA 检测
• 1.2.5 少孢节丛孢菌目的基因PCR 扩增
• 1.2.6 PCR 结果检测
• 1.2.7 PCR 扩增基因片段的纯化和回收
• 1.2.8 序列测定与分析
• 2 结果
• 2.1 基因组DNA 检测
• 2.2 PCR 扩增结果
• 2.3 PCR 扩增产物的酶切位点分析
• 2.4 目的基因片段的BLASTN 结果
• 2.5 少孢节丛孢菌内蒙分离株和GENBANK 中相关分离株的比较分析
• 2.6 丝氨酸蛋白酶氨基酸序列的比较分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 本课题创新点
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介