福州荔枝古树离体种质保存及抗性基因SOD的克隆与表达

论文摘要

福州荔枝种植历史悠久，保留有大量的荔枝古树，具有重要的历史文化价值和科研价值。为了更好的保护福州的荔枝古树，并挖掘其抗性基因资源，本研究拟在本实验室以往的研究基础上，优化荔枝古树胚性愈伤组织（embryogenic callus, EC）的限制生长保存条件，并进一步保存福州主要的荔枝古树资源；从荔枝古树花药EC克隆抗性基因SOD的三类型基因，并进行离体保存过程中的SOD基因的定量表达分析以及在低温下的SOD活性变化测定。主要结果如下：1福州荔枝古树EC限制生长保存条件的优化1.1荔枝古树胚性愈伤组织的诱导与保持本研究首先对福州部分荔枝古树（西禅寺的X1、X2（“宋荔”）、X3、X6、X8、X9、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20荔枝古树、乌山的W3、W4荔枝古树、华侨大厦的H3荔枝古树）胚性愈伤组织进行诱导，结果表明，胚性愈伤组织的诱导与植物激素的类型、浓度及其组合密切相关，除X11和X19荔枝古树在培养基M1上的胚性愈伤组织诱导率比在M2上高，其余荔枝古树单株花药在M2中诱导率比M1高。同一培养基，不同荔枝古树单株间花药愈伤组织诱导率差异较大，X11在M1中诱导率高达79.55%，H3在M1中的诱导率为0.00%。刚诱导的愈伤组织胚性强，且同一荔枝古树单株在不同培养基中体胚发生量也不同。诱导出来的胚性愈伤组织在M1和M2培养基上，黑暗中交替培养4代后，转接到M1和M2激素减半的培养基中，于弱光下交替培养，可长期保存；多次继代后，X12、X14、X15、X16、X17仍然具有较多的胚状体生成。1.2荔枝古树胚性愈伤组织的限制生长保存条件的优化以X2的胚性愈伤组织为试材，根据蔗糖、甘露醇、肌醇和温度进行正交试验设计，对荔枝古树胚性愈伤组织进行限制生长保存研究。结果表明，X2胚性愈伤组织的最佳保存条件（G7）是19℃下，在MS+1.0mg.L-12,4-D+20g.L-1蔗糖+20g.L-1甘露醇+0.3g.L-1肌醇的培养基上进行保存。低温培养有利于提高X2胚性愈伤组织的细胞活力；X2胚性愈伤组织生长率与蔗糖浓度呈负相关，但提高蔗糖浓度有利于X2生长量的增加。2福州主要的荔枝古树资源的离体保存不同荔枝古树单株胚性愈伤组织在最佳保存条件（G7）下的保存结果表明，X6、X8、X12、X14、X15、X16、X17在保存过程中均有较多的体胚发生，保存时间较短，只保存100d左右，其余大部分荔枝古树生长良好，能保存120d，其中40、44和H3保存时间较长，可达135d；33、40、44在保存过程中的生长量明显比大部分新诱导的胚性愈伤组织大，这22份荔枝古树胚性愈伤组织在G7的保存条件下均可正常地继代保存。3福州荔枝古树胚性愈伤组织SOD三类型基因的克隆本研究采用RT-PCR和RACE法成功获得了福州荔枝古树胚性愈伤组织SOD三类型基因的11条cDNA全长和1条cDNA部分序列。3.1荔枝古树胚性愈伤组织Fe-SOD的克隆本研究共获得了8个荔枝古树胚性愈伤组织Fe-SOD成员和1条部分序列，其中，LcFe-SOD2（JQ771621）为部分序列，共有885bp；LcFe-SOD（JN671967.2）、LcFe-SOD1（JQ771618）和LcFe-SOD5（JQ861697）全长分别为1176bp、1205bp和756bp，分别编码236、174和159个氨基酸；LcFe-SOD1A（JQ861693）、LcFe-SOD1B（JQ861694）、LcFe-SOD3（JQ861695）、LcFe-SOD4（JQ861696）和LcFe-SOD6（JQ861698）均为开放阅读框，LcFe-SOD1A和LcFe-SOD1B均为525bp，与LcFe-SOD1编码同一蛋白质；LcFe-SOD3为525bp，编码174个氨基酸；LcFe-SOD4为414bp，编码137个氨基酸；LcFe-SOD6为711bp，编码236个氨基酸。LcFe-SOD1和LcFe-SOD4是可变剪接体，二者可变剪接位置均发生在基因编码区，均改变了原有蛋白的翻译，但它们的可变剪接模式不同，LcFe-SOD1属于内含子保留剪接模式，而LcFe-SOD4属于外显子被选择性切除模式。生物信息学分析表明，Fe-SOD不同成员蛋白均是具有1个卷曲螺旋结构的、不含信号肽和跨膜结构的酸性不稳定亲水蛋白。LcFe-SOD和LcFe-SOD6可能定位于微体（过氧物酶体），而LcFe-SOD1、LcFe-SOD3、LcFe-SOD4和LcFe-SOD5蛋白均可能定位于细胞质；Fe-SOD不同成员蛋白均以丝氨酸为主和酪氨酸为辅发生磷酸化反应，且都属于Mn/FeSOD家族，其中LcFe-SOD和LcFe-SOD6的保守结构和位置一样，均含有Mn/FeSOD家族的N-末端和C-末端保守结构域和4个专属MnSODISMTASE蛋白家族的结构域；LcFe-SOD1和LcFe-SOD3的保守结构和位置一样，都不含Mn/FeSOD家族的N-末端保守结构域，只含C-末端保守结构域和2个专属MnSODISMTASE蛋白家族的结构域；LcFe-SOD4只含C-末端保守结构域，无MnSODISMTASE蛋白家族的专属结构域；LcFe-SOD5只含C-末端保守结构域和2个专属MnSODISMTASE蛋白家族的结构域。3.2荔枝古树胚性愈伤组织Mn-SOD的克隆本研究获得了1条荔枝古树胚性愈伤组织Mn-SOD的ORF序列，命名为LcMn-SOD（HQ661041），该序列大小为665bp，含有起始密码子（ATG）和终止密码子（TGA），共编码221个氨基酸。对其进行生物信息学分析，结果表明，LcMn-SOD是不含信号肽、无卷曲螺旋结构和跨膜结构的碱性稳定亲水蛋白，定位于线粒体基质空间、微体（过氧化物酶体）、线粒体内膜和线粒体体膜间隙空间的可能性比较大，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化水平相近，属于Mn/FeSOD家族且含有该家族的N-末端和C-末端保守结构域，同时含有5个专属MnSODISMTASE蛋白家族的结构域。3.3荔枝古树胚性愈伤组织Cu/Zn-SOD的克隆本研究共获得了2条荔枝古树胚性愈伤组织Cu/Zn-SOD不同成员的cDNA全长，分别命名为LcCu/Zn-SOD1（JQ771619）和LcCu/Zn-SOD2（JQ771620），大小分别为677bp和700bp，均含有起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA），不含3’UTR。LcCu/Zn-SOD2是可变剪接体，其可变剪接位置发生5’UTR区，不改变原有蛋白的翻译，属于内含子保留剪接模式。二者编码同一个蛋白，是不含信号肽和卷曲螺旋结构的酸性稳定亲水蛋白，含有2个跨膜结构，定位于叶绿体和线粒体，丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平相同，无酪氨酸磷酸化发生，含有4个专属Cu/Zn-SODISMTASE蛋白家族的结构域，同时具有Cu/Zn-SOD特征1和特征2的结合位点。4荔枝古树胚性愈伤组织保存过程中SOD基因的定量表达分析本试验以GAPDH基因为内参，进行荧光定量PCR分析LcFe-SOD、LcMn-SOD和LcCu/Zn-SOD1在最佳保存条件（G7）和普通保存条件（M3）下的表达变化规律，结果显示，不论在最佳保存条件还是普通保存条件下，保存前期（10-30d），LcFe-SOD、LcMn-SOD和LcCu/Zn-SOD1三者共同调控愈伤组织的生长。保存中期（30-50d），两种保存条件下愈伤组织的生长主要由LcFe-SOD和LcCu/Zn-SOD1共同调控。保存后期（50-90d），最佳保存条件（G7）下主要由不同SOD基因间相互协调，此消彼长，相互调控，以维持荔枝古树胚性愈伤组织SOD的动态平衡。LcFe-SOD和LcCu/Zn-SOD1在G7整个保存过程中起关键调控作用。5最佳保存条件和普通保存条件下荔枝古树胚性愈伤组织SOD活性的变化在确定G7是最佳保存方案的基础上，进一步探讨G7和普通保存条件下荔枝古树胚性愈伤组织SOD酶活性的变化。研究发现，G7下，随着保存时间的延长，X2胚性愈伤组织SOD酶活性先平稳下降而后又有所上升，然后迅速下降到最低值，之后又稳定上升到最高值，最后又稳定下降。普通保存条件下，前30d荔枝古树X2SOD酶活性缓慢上升，在30d达到最大值，之后随着保存时间的延长，SOD酶活性迅速下降。最佳保存条件明显推迟SOD活性峰值的出现，延长了荔枝古树EC的保存期限。6低温胁迫下荔枝古树胚性愈伤组织SOD活性的变化对荔枝古树胚性愈伤组织进行低温胁迫研究，结果表明，X2胚性愈伤组织SOD酶活性在20℃下活性最高，并推测出5℃可能是X2的冷害临界温度，低温明显抑制X2胚性愈伤组织SOD酶活性；X11具有较强的抗寒能力，但其抗寒能力低于其它荔枝古树；40、W3、W4、H3、44、X2、hy30的抗寒能力相似。

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摘要

Abstract

第一章引言

1 名木古树保护现状

2 植物离体种质保存研究现状

2.1 限制生长保存的研究进展

2.2 超低温保存的研究进展

3 植物 SOD 研究现状

3.1 SOD 与抗逆性

3.2 SOD 基因工程

4 荔枝古树保护现状

5 本试验研究的意义与内容

5.1 本试验研究的意义

5.2 本试验研究的内容

第二章福州荔枝古树离体种质资源的限制生长保存研究

第一节荔枝古树花药胚性愈伤组织的诱导

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 外植体的处理

1.2.2 诱导培养基

1.2.3 花药愈伤组织的诱导

1.2.4 初始诱导胚性愈伤组织的继代保存

1.2.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同荔枝古树单株在不同培养基上的诱导情况

2.2 荔枝古树胚性愈伤组织的继代保持

3 讨论

3.1 荔枝古树花药胚性愈伤组织诱导的影响因素

3.2 古树离体种质保存的可行性

第二节荔枝古树离体种质资源的限制生长保存研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 培养条件

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同因素对荔枝古树离体保存过程中 EC 细胞活力的极差分析

2.2 不同因素对荔枝古树离体保存过程中 EC 细胞活力的方差分析

2.3 各个处理间荔枝古树 EC 细胞活力的新复极差测验

2.4 不同因素对荔枝古树离体保存过程中 EC 生长率的极差分析

2.5 不同因素对荔枝古树离体保存过程中 EC 生长率的方差分析

2.6 各个处理间荔枝古树 EC 生长率的新复极差测验

2.7 不同因素对荔枝古树离体保存过程中 EC 生长量的极差分析

2.8 不同因素对荔枝古树离体保存过程中 EC 生长量的方差分析

2.9 各个处理间荔枝古树 EC 生长量的新复极差测验

2.10 福州主要的荔枝古树资源的离体保存

2.11 最佳保存条件及基本保存条件下荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 酶活性差异

3 讨论

3.1 适当低温培养有利于提高荔枝古树胚性愈伤组织的细胞活力

3.2 蔗糖是影响荔枝古树胚性愈伤组织生长的关键因素

3.3 离体保存过程中不同荔枝古树胚性愈伤组织生长差异的可能因素

第三节低温胁迫下荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 活性的变化

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 荔枝古树胚性愈伤组织低温胁迫处理

1.2.2 荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 粗酶液的提取

1.2.3 荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 酶活力的测定

2 结果与分析

2.1 不同低温胁迫对荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 活性的影响

2.2 不同处理时间下荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 活性的变化

2.3 不同荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 活性差异比较

2.4 荔枝古树 X11 胚性愈伤组织低温胁迫下 SOD 活性的变化

3 讨论

3.1 荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 活性与抗寒性的关系

3.2 低温胁迫下荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 的响应机制

第三章荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 基因的克隆及生物信息学分析

第一节荔枝古树胚性愈伤组织 Fe-SOD 多基因的克隆及生物信息学分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 荔枝古树胚性愈伤组织总 RNA 的提取

1.2.2 荔枝古树胚性愈伤组织 Fe-SOD 多基因 cDNA 的克隆

2 结果与分析

2.1 荔枝古树胚性愈伤组织 Fe-SOD 基因不同成员保守序列的扩增

2.2 荔枝古树胚性愈伤组织 Fe-SOD cDNA 3’末端序列的扩增

2.3 荔枝古树胚性愈伤组织 Fe-SOD cDNA 5’末端序列的扩增

2.4 荔枝古树胚性愈伤组织 Fe-SOD 全长 cDNA 的验证

2.5 荔枝古树胚性愈伤组织 Fe-SOD 不同成员的生物信息学分析

3 讨论

3.1 Fe-SOD 基因在荔枝古树胚性愈伤组织离体保存中的可能作用机制

3.2 荔枝古树胚性愈伤组织 Fe-SOD 蛋白磷酸化的磷酸化现象

3.3 荔枝古树胚性愈伤组织中 Fe-SOD 基因的可变剪接现象

第二节荔枝古树胚性愈伤组织 Mn-SOD 基因的克隆及信息生物学分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 荔枝古树胚性愈伤组织总 RNA 的提取

1.2.2 荔枝古树胚性愈伤组织 Mn-SOD 基因 cDNA 的克隆

2 结果与分析

2.1 荔枝古树胚性愈伤组织 Mn-SOD 基因 ORF 的扩增

2.2 荔枝古树胚性愈伤组织 LcMn-SOD 基因的生物信息学分析

3 讨论

3.1 LcMn-SOD 基因在荔枝古树胚性愈伤组织离体保存过程中的可能作用机理

3.2 酪氨酸磷酸化对荔枝古树胚性愈伤组织离体保存可能具有重要调控作用

第三节荔枝古树胚性愈伤组织 Cu/Zn-SOD 基因的克隆及信息生物学分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 荔枝古树胚性愈伤组织总 RNA 的提取

1.2.2 荔枝古树胚性愈伤组织 Cu/Zn-SOD 基因 cDNA 的克隆

2 结果与分析

2.1 荔枝古树胚性愈伤组织 Cu/Zn-SOD 基因保守序列的扩增

2.2 荔枝古树胚性愈伤组织 Cu/Zn-SOD cDNA5’末端序列的扩增

2.3 荔枝古树胚性愈伤组织 Cu/Zn-SOD 基因全长序列拼接与分析

2.4 荔枝古树胚性愈伤组织 Cu/Zn-SOD 的生物信息学分析

3 讨论

3.1 LcCu/Zn-SOD1 在荔枝古树胚性愈伤组织离体保存过程中的可能作用机理

3.2 荔枝古树胚性愈伤组织中 Cu/Zn-SOD 存在可变剪接现象

第四章荔枝古树胚性愈伤组织保存过程中 SOD 基因的定量表达分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 总 RNA 的提取与质量检测

1.2.2 cDNA 的合成

1.2.3 qPCR 引物设计

1.2.4 两步法 qRT-PCR

2 结果与分析

2.1 LcFe-SOD、LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD1qPCR 引物特异性及扩增效率分析

2.2 最佳保存条件（G7）下 LcFe-SOD 的表达模式分析

2.3 最佳保存条件（G7）下 LcMn-SOD 的表达模式分析

2.4 最佳保存条件（G7）下 LcCu/Zn-SOD1 的表达模式分析

2.5 普通保存条件（M3）下 LcFe-SOD 的表达模式分析

2.6 普通保存条件（M3）下 LcMn-SOD 的表达模式分析

2.7 普通保存条件（M3）下 LcCu/Zn-SOD1 的表达模式分析

2.8 两种保存条件下，LcFe-SOD、LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD1 表达模式的相互关系

3 讨论

3.1 荔枝古树 SOD 酶活性与 SOD 表达模式比较分析

3.2 LcFe-SOD 和 LcCu/Zn-SOD1 在荔枝古树胚性愈伤组织离体保存过程中起主要调控作用

第五章小结

1 荔枝古树的离体保存研究

1.1 荔枝古树胚性愈伤组织的诱导

1.2 荔枝古树胚性愈伤组织的限制生长保存研究

1.3 低温胁迫下荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 活性的变化

2 荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 基因的克隆

2.1 荔枝古树胚性愈伤组织 Fe-SOD 基因的克隆

2.2 荔枝古树胚性愈伤组织 LcMn-SOD 开放阅读框的克隆

2.3 荔枝古树胚性愈伤组织 Cu/Zn-SOD 的克隆

3 荔枝古树胚性愈伤组织保存过程中 SOD 基因的定量表达分析

参考文献

附录

附录 1 图版及图版说明

附录 2 GenBank 上登录的福州荔枝古树胚性愈伤组织 SOD 三类型基因的 cDNA 序列

致谢

福州荔枝古树离体种质保存及抗性基因SOD的克隆与表达

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