论文摘要
在基因组学与蛋白质组学领域,已经有许多令人瞩目的研究成果。随着脂质组学概念的提出,人们日益发现脂质的功能并不仅仅只局限于以前所认识到的,它们在生物领域发挥的作用可能超出了人们的想象。脂筏就是一种位于细胞膜上由脂质构成的功能单位体。它由丰富的鞘脂、胆固醇及特定的蛋白质动态聚集而成,形成相对稳定的具有一定功能的筏结构漂浮于流动的细胞膜中。当细胞受到某种刺激时,脂筏被酸性鞘磷脂酶（ASM）激活并释放出大量由鞘磷脂水解而来的神经酰胺,后者迅速相互联接形成微区,这些微区又可以迅速联结形成一个或几个平台区。神经酰胺富含膜区为蛋白质等生物活性分子之间的相互作用提供了平台。脂筏广泛参与了细胞的各种生物学行为,在信号转导中发挥的作用尤为重要。支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病,与多种炎症细胞及炎症介质相关,气道上皮细胞是气道炎症的主要效应细胞。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是哮喘炎症过程中重要的启动因子,它可以通过激活NF-κB诱导一系列炎症介质的产生,导致气道上皮细胞损伤以及气道粘液过度分泌。NF-κB广泛存在于各种组织细胞,能与多种基因启动子上κB序列结合并促进转录,通过调控许多重要的细胞因子,粘附分子,趋化因子的基因表达而参与机体的各种免疫炎症反应。DUOX-1是糖蛋白p91Phox的同系物,可以表达于气道上皮细胞,能够催化其底物产生过氧化氢,引起细胞损伤并刺激细胞分泌大量粘液。本研究拟探讨脂筏-神经酰胺通路在TNF-α引起的NF-κB激活以及其下游靶基因的表达中是否发挥作用,以期为哮喘等气道炎症性疾病的防治提供新的策略。目的人气道上皮细胞膜脂筏-神经酰胺被破坏后,TNF-α刺激细胞引起的NF-κB激活及DUOX1表达所受到的影响。DUOX1的表达是否依赖NF-κB的激活。方法1.基于ELISA的转录因子活性测定方法检测细胞内NF-κB活性。用5ng/ml,10ng/ml,15ng/ml TNF-α分别处理人气道上皮细胞15min,30min,60min。选取能最大程度激活NF-κB的TNF-α浓度和刺激时间进行细胞分组实验并检测细胞内NF-κB活性。①对照组②TNF-α刺激组: 10ng/mlTNF-α处理细胞15min。③胆固醇剔除剂甲基-β-环糊精（M-β-CD）M-β-CD组:10mM M-β-CD处理细胞30min。④MT组: M-β-CD处理细胞后再用TNF-α刺激细胞。⑤胆固醇结合剂菲律宾菌素Ⅲ（FilipinⅢ）,Filipin组:用6ug/ml Filipin处理细胞1小时。⑥FT组:用Filipin处理细胞后再用TNF-α刺激细胞。⑦酸性鞘磷脂酶抑制剂地昔帕明（Desipramine）,Desipramine组:10μM Desipramine处理细胞1小时。⑧DT组:用Desipramine处理细胞后再用细胞因子刺激细胞。2. Western blot检测细胞DUOX-1的表达。细胞分组为:①对照组②TNF-α刺激组: 10ng/ml TNF-α处理细胞3小时。③M-β-CD组:10mM M-β-CD处理细胞30min。④MT组:MβCD处理细胞后再用TNF-α刺激细胞。⑤Desipramine组:10μM Desipramine处理细胞1小时。⑥DT组:Desipramine处理细胞后再用TNF-α刺激细胞。3.免疫组化观察细胞浆中DUOX-1的表达。细胞分组为:①对照组②TNF-α刺激组:10ng/ml TNF-α处理细胞3小时。③MT组:10mM M-β-CD处理细胞30min后再用TNF-α刺激细胞。④DT:10μM Desipramine处理细胞1小时细胞后再用TNF-α刺激细胞。4. DNA decoy。细胞分组为:①对照组。②TNF-α刺激组:10ng/ml TNF-α处理细胞3小时。③转染试剂组:转染试剂处理细胞过夜。④DNA转染组:用转染试剂将DNA双链转染到细胞内后,再用10ng/ml TNF-α处理细胞。5.统计分析:单因素方差分析。结果1.10ng/ml TNF-α处理气道上皮细胞15min激活细胞内NF-κB最明显（P<0.05）。脂筏干扰剂可以抑制TNF-α刺激引起的NF-κB活性增加（P<0.05）。2. TNF-α刺激细胞引起DUOX-1表达增加（P<0.05）。脂筏干扰剂可以抑制TNF-α刺激引起的DUOX-1表达增加（P<0.05）。3. TNF-α刺激细胞后,在电镜下其胞浆中DUOX-1颗粒明显增加。脂筏干扰剂可以抑制TNF-α刺激引起的DUOX-1颗粒增加。4.NF-κB的DNA结合序列转染到细胞内后可以抑制TNF-α刺激引起的细胞DUOX-1表达增加（P<0.05）。结论1.TNF-α可以明显激活气道上皮细胞内NF-κB;脂筏-神经酰胺信号通路参与了TNF-α所携带的信号向细胞内的转导。2.TNF-α可以引起气道上皮细胞DUOX-1表达增加; DUOX-1的表达依赖NF-κB的激活,这一过程也依赖于脂筏-神经酰胺信号通路。3.脂筏干扰剂M-β-CD、FilipinⅢ以及Desipramine有望用于支气管哮喘等气道炎症性疾病的治疗。
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