论文摘要
灰飞虱（Laodelphax striatellus）是我国粮食作物上的一种重要害虫,它不仅刺吸取食水稻等禾本科植物的汁液造成直接危害,而且还能传播病毒引起水稻条纹叶枯病和灰条矮缩病等。自20世纪60年代大发生之后,经过几十年的潜伏期,灰飞虱在90年代后期又一次暴发并持续至今,并导致2000年以来条纹叶枯病在江淮稻区日益严重。目前对灰飞虱的防治主要以化学防治为主,由于长期使用化学农药,不仅造成了严重的环境污染,也使得灰飞虱的抗药性增强,因此急需研究和开发新的灰飞虱防治技术。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种由双链RNA诱发的转录后水平的基因沉默现象,广泛存在于真菌、植物和动物中。基于RNAi原理,通过转基因技术,使寄主作物或杀虫微生物表达害虫重要功能基因的dsRNA,就可以使害虫在取食作物或被微生物侵染后,自身功能基因表达受阻从而达到害虫控制的目的。这一害虫防治新策略已经引起世界范围内的极大关注。为了探讨基于RNAi策略的灰飞虱防治新技术,本文利用灰飞虱转录组数据并采用RACE技术,对灰飞虱一些重要功能基因进行了全长克隆；在此基础上,利用喂食法对这些基因对灰飞虱的RNAi致死效应进行了测定；此外,为了筛选合适的qRT-PCR用灰飞虱内参基因,还对几个灰飞虱持家基因的表达稳定性进行了分析。主要研究结果如下：1.通过灰飞虱转录组数据分析并结合RACE技术,克隆了12个灰飞虱基因的5’端和7个基因的全长cDNA序列。7个全长序列包括tubulin基因3个、ADP核糖基化因子基因（ARF）、60s核糖体蛋白L9基因（RPL9）、糖转运因子（ST）和保幼激素结合蛋白基因（JHBP）各1个,分别命名为LstrTUB1 （Genbank登录号：JF728809）、LstrTUB2 （Genbank登录号：JF728810）、LstrTUB3 （Genbank登录号：JF728811）、LstrARF（Genbank登录号：JF728807）、LstrRPL9（Genbank登录号：JF728806）、LstrST （Genbank登录号：JN050856）及LstrJHBP （Genbank登录号：JF728808）。片段及全长cDNA的克隆为基因功能、RNAi致死效应等研究奠定了基础。2.通过dsRNA喂食法,测定了15个功能基因对2龄灰飞虱若虫的RNAi致死效应。结果表明,其中CHI7、RPL9-2、ST等7个基因的效果较好,处理120h后平均校正死亡率在40%以上,以CHI7最高达64%; ATPase和a2-TUB效果较差,平均校正死亡率在20%以下；其他6个基因居中,校正死亡率在20-40%间。以CHI7为例进行的qRT-PCR检测表明,dsRNA处理后72h CHI7的表达量下降了57%,说明本RNAi方法的有效性。这是首次在灰飞虱中实现了RNAi,该方法的建立及对不同基因的测定结果为基于RNAi的灰飞虱防治技术提供了基础。3.对克隆得到的灰飞虱保幼激素结合蛋白基因LstrJHBP,进一步就该基因的归类、表达动态及对灰飞虱若虫的RNAi致死效应进行了研究。综合信号肽预测、氨基酸序列比对及进化分析结果,认为LstrJHBP是一个细胞质JHBP。利用qRT-PCR的测定表明,LstrJHBP在灰飞虱若虫5个龄期及雌雄成虫均有表达,但4龄若虫期显著高于其他龄期；雌雄成虫间没有显著差异。以喂食法对2龄若虫进行的RNAi实验的结果表明,当dsRNA的喂食浓度为56.65ng/ul并连续喂食5天,处理组的若虫死亡率与对照间没有显著差异。4.灰飞虱中qRT-PCR常用的内参基因是β-肌动蛋白（β-Actin）,但实验表明其稳定性并不很好。为了确定合适的灰飞虱内参基因,在克隆到5个持家基因全长cDNA序列基础上,进一步对该5个持家基因（3个tubulin基因、ADP核糖基化因子基因和60s核糖体蛋白L9基因各1个）及β-Actin在灰飞虱若虫不同龄期的表达量进行了测定,并利用geNorm及NormFinder软件进行了表达稳定性分析。研究表明,在灰飞虱中ARF和RPL9的稳定性高于β-Actin,可以作为替代内参基因；并且,当ARF和RPL9同时使用时,所得定量结果的误差更小。