有机磷及氨基甲酸酯类农药残留检测用豇豆酯酶的初步研究

论文摘要

植物酯酶由于其来源丰富、价格低廉、检测灵敏性好等优点,在现代农药残留检测中有着良好的应用前景。本试验基于酶抑制原理,以常用植物酯酶酶源小麦为对照,以比活力和农药敏感性为测定指标,对10种植物酶源进行筛选。并对筛选出的适用于农药残留检测用的豇豆酯酶的提取、分离、固定化条件、酶学性质以及对11种有机磷及氨基甲酸酯类农药敏感性进行了研究。其主要研究结果如下:1.在小麦（Triticum aestivuml.L）、杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）、刺槐（Robinia pseudacacia L.）、国槐（Sophora japonica L.）、腊梅（Chimonanthus praecox （L.））、洒金柏（ Cv.aurea.nana ）、侧柏（ Platycladus orientalis （L.） Franco ）、黄豆（ Giycine max（L）Merrill）、绿豆（Vigna radiata）、菜豆（Phaseolus vulgaris Linn.）、豇豆（Vigna unguiculata （Linn.））和家蝇等12种材料中,豇豆酯酶比活力极显著高于其它酯酶,豇豆酯酶比活力是小麦的4.71倍,是敏感性家蝇乙酰胆碱酯酶的3.84倍。对敌敌畏、辛硫磷、敌百虫、速灭威、克百威和灭幼脲等6种有机磷及氨基甲酸酯类农药的敏感性测定显示:除小麦酯酶对辛硫磷和灭幼脲的灵敏度略高于豇豆外,豇豆酯酶对其他4种农药的灵敏度明显优于小麦,其对敌百虫灵敏度最好,达33.625,对敌敌畏等3种农药的灵敏度约是小麦酯酶的3-7倍。2.豇豆酯酶最佳提取条件为:豇豆种子粉碎后过100目筛,按照料液比1:5加入0.3 mol/L pH 7.5的磷酸盐缓冲液,于4℃条件下浸提14h,在10000r/min冷冻离心机下离心15min,上清液即为粗酶液。3.采用Box-Behnken设计法对其酶促反应条件进行优化,结果显示,酶液稀释1977倍后,在0.324mol/L pH 7.57的磷酸缓冲液中,30℃时酯酶的催化活性最高;三个因素对豇豆酯酶活力影响程度为稀释倍数>pH值>缓冲液摩尔浓度。4.确定了两次硫酸铵盐析饱和度分别为50%和55%,豇豆酯酶经两次硫酸铵盐析,透析浓缩后上RESOURCE Q离子交换柱进行交换层析后的比活力比粗酶液比活力明显提高。5.豇豆酯酶在20℃-40℃时热稳定性较好,20℃保温60min,酶残留活力为95.69%;30℃保温60min,残留活力为92.21%;40℃保温60min,残留活力为83.65%。豇豆酯酶米氏常数Km为1.303μmol/L。6.豇豆酯酶对11种有机磷及氨基甲酸酯类农药敏感性测定结果显示:豇豆酯酶除对久效磷外,对其他10种农药的灵敏性都较好,最低检测限均低于其MRL值。通过纯化前后的豇豆酯酶对6种农药灵敏性测定结果表明,纯化前后的酯酶对农药的灵敏性无显著差异。7.豇豆酯酶固定化的酶用量、固定化温度及固定化时间分别以5U/mL的酶液8mL、4℃和12h为最佳。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述与立题依据
• 1.1 研究目的及内容
• 1.1.1 研究目的
• 1.1.2 研究的内容
• 1.2 农药的概述
• 1.2.1 农药残留的危害及原因
• 1.2.2 农药残留的解决对策
• 1.3 农药残留检测技术的概述
• 1.3.1 常规仪器检测方法
• 1.3.2 免疫分析法
• 1.3.3 酶抑制法
• 1.4 植物酯酶
• 1.4.1 酶源的筛选
• 1.4.2 酶的纯化
• 1.4.3 酶的固定化
• 1.5 立题依据
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试剂及仪器
• 2.2.1 试验试剂
• 2.2.2 试验仪器
• 2.3 实验设计与方法
• 2.3.1 相关计算公式
• 2.3.2 酯酶活力的测定方法
• 2.3.3 植物酯酶对农药敏感性测定
• 2.3.4 最低检测限的测定
• 2.3.5 农药残留检测用植物酯酶酶源的筛选
• 2.3.6 豇豆酯酶提取条件的筛选
• 2.3.7 豇豆酯酶的分离
• 2.3.8 豇豆酯酶的酶学性质研究
• 2.3.9 豇豆酯酶对农药灵敏性和最低检测限的测定
• 2.3.10 豇豆酯酶酶的固定化
• 第三章 结果与分析
• 3.1 标准曲线的绘制
• 3.1.1 α-萘酚的标准曲线制作
• 3.1.2 蛋白质含量的标准曲线制作
• 3.2 农药残留检测用植物酯酶酶源的筛选
• 3.2.1 10 种植物酯酶与小麦酯酶比活力的比较
• 3.2.2 豇豆酯酶与家蝇乙酰胆碱酯酶活力的差异
• 3.2.3 豇豆酯酶和小麦酯酶对6 种农药灵敏性的比较
• 3.2.4 小结
• 3.3 豇豆酯酶提取条件的选择
• 3.3.1 料液比的选择
• 3.3.2 浸提时间的选择
• 3.3.3 离心速率的选择
• 3.3.4 离心时间的选择
• 3.3.5 提取液pH 值的选择
• 3.3.6 小结
• 3.4 豇豆酯酶的分离
• 3.4.1 硫酸铵盐析试验
• 3.4.2 RESOURCE Q 阴离子交换柱层析
• 3.4.3 豇豆酯酶纯化效果的比较
• 3.4.4 纯化前后豇豆酯酶对农药灵敏性的比较
• 3.4.5 小结
• 3.5 豇豆酯酶的酶学性质研究
• 3.5.1 最适反应pH 值的选择
• 3.5.2 最适缓冲液摩尔浓度的选择
• 3.5.3 最佳酶液的稀释倍数的选择
• 3.5.4 最适反应温度的选择
• 3.5.5 豇豆酯酶的热稳定性
• 3.5.6 豇豆酯酶米氏常数的测定
• 3.5.7 豇豆酯酶酶促反应条件的优化
• 3.5.8 小结
• 3.6 豇豆酯酶对农药灵敏性和最低检测限的测定
• 3.7 豇豆酯酶的固定化
• 3.7.1 固定化条件的选择
• 3.7.2 小结
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 4.2.1 关于适用于农药残留检测用植物酯酶的筛选
• 4.2.2 关于豇豆酯酶分离纯化
• 4.2.3 关于豇豆酯酶的提取、分离、固定化工艺
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介