耐高温β-葡聚糖酶产生菌株的筛选及酶学性质的研究

论文摘要

β-葡聚糖是谷物细胞壁主要的结构组成部分,在啤酒及饲料工业生产中产生负面影响。β-葡聚糖是重要的工业用酶,可有效消除谷物β-葡聚糖在酿造和饲料工业产生中的负面影响。目前,热稳定性是β-葡聚糖酶推广应用中较为突出的问题。饲料生产中的制粒过程需要经过高温加热,一般在70℃-80℃,β-葡聚糖酶在这样的温度下很容易失活,所以进一步筛选耐热性能更好的β-葡聚糖酶以及探索提高β-葡聚糖酶酶活仍是研究重点。本研究从自然筛选入手,以开发耐热β-葡聚糖酶为目标,进行了以下几方面的研究：（1）耐热β-葡聚糖酶产生菌的分离筛选。（2）耐热β-葡聚糖酶产生菌W-9的初步鉴定,包括形态、生理生化及16SrDNA的鉴定。（3）耐热β-葡聚糖酶W-9液体产酶条件的研究。（4）耐热β-葡聚糖酶W-9的蛋白质纯化、酶促动力学及酶学性质研究。从土壤中筛选到一株热稳定性能较好的β-葡聚糖酶产生菌W-9,37℃发酵72h酶活性为82.64U/ml,经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）.就W-9所产β-葡聚糖酶的酶学性质进行了研究。结果显示,β-葡聚糖酶的等电点为3.8,分子量为32KDa,最适反应pH为6.0,最适反应温度为70℃。其动力学参数Km=8.25（mg/mL）, Vmax=11.88（mg/mL/min）方程为Y=0.6947x+0.0842。与目前其他p-葡聚糖酶相比,菌株W-9所产的β-葡聚糖酶具有较好的耐热性和更广的pH耐受范围,性能更优良,在饲料及酿酒等领域具有更大的工业化生产潜力。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 英文缩略表及中英文对照
• 第一章 绪论
• 1.1 β-葡聚糖概述
• 1.1.1 β-葡聚糖的形态、来源及性质
• 1.1.2 β-葡聚糖的负面作用
• 1.1.3 β-葡聚糖的其他作用
• 1.2 β-葡聚糖酶概述
• 1.2.1 β-葡聚糖酶的结构、分类及作用机理
• 1.2.2 β-葡聚糖酶的来源及酶学性质
• 1.2.3 β-葡聚糖酶的应用及研究现状
• 1.3 本课题的选题依据及研究目的
• 1.4 研究内容
• 第二章 β-葡聚糖酶产生菌的分离筛选及菌种初步鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 菌株的筛选
• 2.1.3 酶活测定
• 2.1.4 耐热β-葡聚糖酶产生菌W-9菌株的初步鉴定
• 2.2 实验结果与分析
• 2.2.1 菌种筛选结果
• 2.2.2 标准曲线的绘制
• 2.2.3 W-9菌株的初步鉴定
• 2.2.4 16S rDNA序列分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 耐热β-葡聚糖酶产生菌W-9液体发酵条件的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 粗酶液的制备
• 3.1.5 酶活的测定
• 3.1.6 单因素发酵条件的优化
• 3.1.7 菌株W-9发酵条件的正交优化实验
• 3.1.8 正交结果验证
• 3.2 实验结果与分析
• 3.2.1 单因子发酵条件的研究
• 3.2.2 菌株W-9发酵条件的正交优化实验结果
• 3.2.3 正交结果验证
• 3.3 本章小结
• 第四章 蛋白质的分离纯化、酶促动力学及酶学性质研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株、培养基和培养方法
• 4.1.2 主要仪器和试剂
• 4.1.3 β-葡聚糖测定方法
• 4.1.4 蛋白质含量测定方法
• 4.1.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.1.6 枯草芽孢杆菌W-9产β-葡聚糖酶蛋白质的分离纯化
• 4.1.7 枯草芽孢杆菌W-9的酶促动力学
• 4.1.8 枯草芽孢杆菌W-9的酶学性质的研究
• 4.1.9 金属离子对W-9产酶活力的影响
• 4.1.10 菌株W-9的产物分析
• 4.1.11 枯草芽孢杆菌W-9的的应用性实验
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 蛋白质的标准曲线
• 4.2.2 枯草芽孢杆菌W-9产β-葡聚糖酶蛋白质的分离纯化
• 4.2.2.1 枯草芽抱杆菌W-9产β-葡聚糖酶蛋白质等电点的测定
• 4.2.2.2 枯草芽抱杆菌W-9产β-葡聚糖酶蛋白质的硫酸钱沉淀
• 4.2.2.3 枯草芽袍杆菌W-9产β-葡聚糖酶蛋白质的分离纯化
• 4.2.2.4 枯草芽孢杆菌W-9产β-葡聚糖酶蛋白质的分离纯化的电泳结果
• 4.2.3 枯草芽孢杆菌W-9产β-葡聚糖酶的酶促动力学结果分析
• 4.2.4 枯草芽孢杆菌W-9的酶学性质的研究
• 4.2.5 金属离子对W-9产酶活力的影响
• 4.2.6 菌株的产物分析
• 4.2.7 枯草芽孢杆菌W-9的应用性实验
• 4.3 本章小结
• 第五章 研究结果总结及展望
• 5.1 主要的研究结果
• 5.1.1 β-葡聚糖酶产生菌的分离筛选
• 5.1.2 β-葡聚糖酶产生菌W-9的初步鉴定
• 5.1.3 β-葡聚糖酶产生菌W-9的产酶条件研究
• 5.1.4 β-葡聚糖酶产生菌W-9的蛋白质纯化及酶促动力学研究
• 5.1.5 β-葡聚糖酶产生菌W-9的酶学性质的研究及在啤酒中的应用
• 5.2 创新
• 5.3 展望
• 参考文献
• 硕士期间研究成果
• 附录1 菌株W-9 16S RDNA基因序列
• 附录2 SEPHACRYLTM S-200凝胶过滤蛋白质纯化
• TM阴离子交换'>附录3 DEAE SEPHAROSE^TM阴离子交换
• 附录4 麦芽糖化的流程工艺图
• 致谢