Survivin对胃源性及原发性卵巢癌生物学行为影响的实验研究

论文摘要

卵巢癌是妇科最多见的恶性肿瘤之一,分原发癌和转移癌两类。原发占90%以上,是卵巢癌最常见的类型,特别是原发性卵巢上皮癌。同时,卵巢也是许多恶性肿瘤转移的靶器官,卵巢转移癌约占卵巢癌的5-10%,其中以胃肠道恶性肿瘤卵巢转移最多,尤其是胃低分化腺癌。转移和复发是患者死亡的主要原因,到目前为止,手术治疗仍是主要的治疗手段。但大多数患者在明确诊断时已是中晚期,虽经根治性手术切除、化疗等综合治疗,效果仍不能令人满意,5年生存率仅20-30%。特别是以卵巢转移癌在首发病的患者,与原发卵巢癌鉴别困难。由于目前尚缺乏对其发生发展确切分子机制的了解,因而缺少有效地预防和治疗的方法。探讨其发病机制,寻找更好的诊断、预防和治疗措施是目前相关研究的重点。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员,具有调控细胞增殖和细胞凋亡的双重作用。近年来的研究表明,其在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。但其与卵巢癌发生发展的关系及对肿瘤细胞生物学行为的影响研究甚少。本课题从研究Survivin和其他重要的凋亡相关蛋白（VEGF、Smac/DIABLO）在正常卵巢上皮组织、良性卵巢上皮肿瘤、胃源性卵巢转移癌、原发性卵巢上皮癌组织中的表达入手,运用MTT实验、流式细胞仪检测、体外侵袭实验、RT-PCR等方法,探讨Survivin在卵巢上皮癌细胞和胃低分化腺癌细胞增殖、凋亡和迁移侵袭过程中的作用,利用Survivin反义寡核苷酸（Survivin ASODN）技术抑制其在卵巢上皮癌细胞和胃癌低分化腺细胞中的表达,检测癌细胞增殖、凋亡和迁移侵袭能力及Survivin、VEGF、Smac/DIABLO表达的改变,分析Survivin与原发性卵巢上皮癌和胃癌细胞生物学行为的关系,探讨其ASODN的治疗价值和机制。本实验结果提示:Survivin的异常表达可能是影响胃源性卵巢转移癌、原发性卵巢上皮癌生物学行为的重要因素之一;其与VEGF、Smac/DIABLO间的相互作用可能是原发性和转移性卵巢癌发生发展的重要机制之一; Survivin ASODN能有效抑制原发性和转移性卵巢癌发生、发展,从而可能在卵巢癌治疗中发挥重要作用。研究内容和结果如下:第一部分Survivin、VEGF、Smac/DIABLO在胃源性卵巢转移癌中表达和意义目的:研究胃源性卵巢转移癌中Survivin、VEGF、Smac/DIABLO蛋白表达和相互关系,探讨三者在胃源性卵巢转移癌发生、发展中的作用。方法:采用免疫组织细胞化学和流式细胞学方法检测Survivin、VEGF、Smac/DIABLO蛋白在检测胃源性卵巢转移癌、相应胃癌原发病灶、良性卵巢上皮肿瘤组织和正常卵巢上皮组织中表达,并分析其与胃源性卵巢转移癌临床生物学行为的关系。结果:1正常卵巢上皮组织、良性卵巢上皮肿瘤组织、胃源性卵巢转移癌及相应胃癌原发病灶组织中Survivin、VEGF、Smac/DIABLO蛋白表达正常组织和良性组织中Survivin、VEGF蛋白表达阴性或弱阳性,Smac/DIABLO蛋白表达明显。胃源性卵巢转移癌中Survivin、VEGF蛋白表达均明显增强和Smac/DIABLO蛋白表达明显减弱（P<0.05或P<0.01）; Survivin（胞核、胞浆）、Smac/DIABLO、VEGF蛋白表达阳性率分别为（100.0%、90.3%）、77.4%、90.3%;FI分别为1.10±0.09、0.84±0.08和1.12±0.11;胃源性卵巢转移癌中Survivin胞浆表达较原发胃癌明显升高（P<0.05）。2胃源性卵巢转移癌中Survivin、VEGF、Smac/DIABLO蛋白表达相关性卵巢转移癌中Survivin胞核与胞浆表达无相关性（P>0.05）; Survivin胞浆与Smac/DIABLO的表达间呈负相关性（r=﹣0.373、P<0.05）;Survivin胞浆与VEGF的表达间呈正相关性（r=0.397、P<0.05）;Smac/DIABLO和VEGF的表达间无相关性（P>0.05）。3胃源性卵巢转移癌中Survivin、Smac/DIABLO、VEGF蛋白表达与其临床生物学行为（年龄、肿瘤大小、分化、腹水）的关系Survivin胞浆蛋白表达在肿瘤直径≥5cm组（阳性率100.0%; FI=1.16±0.08）明显高于肿瘤直径<5cm（阳性率66.7%; FI=1.04±0.05）组（P<0.05或P<0.01）。与其他临床生物学行为无关（P>0.05）。Smac/DIABLO蛋白表达在低分化组（阳性率94.1%; FI=0.88±0.03）明显高于中分化（阳性率57.1%; FI=0.78±0.09）组（P<0.05）与其他临床生物学行为无关（P>0.05）。VEGF蛋白表达在肿瘤直径≥5cm组（阳性率100.0%; FI=1.18±0.08）明显高于<5cm（阳性率66.7%; FI=1.06±0.11）组（P<0.05）;VEGF蛋白表达在低分化组（FI=1.18±0.07）明显高于中分化组（FI=1.04±0.10）（P<0.01）。与其他临床生物学行为无关（P>0.05）。结论:1胃源性卵巢转移癌中Survivin表达明显增强,且与VEGF蛋白表达存在明显正相关,与Smac/DIABLO蛋白表达存在明显负相关,三者相互作用,可能共同参与了胃源性卵巢转移癌生长和转移的过程。2胃源性卵巢转移癌中Survivin存在细胞核、细胞浆不同定位过表达,Survivin细胞浆表达较胃癌原发灶中显著升高,故Survivin细胞浆表达可能在胃癌卵巢转移中起关键性作用。3检测胃源性卵巢转移癌中Survivin、VEGF、Smac/ DIABLO蛋白水平的表达,可能成为其临床诊断和恶性程度判断的标志。第二部分Survivin、VEGF、Smac/DIABLO在原发性卵巢上皮癌中表达和意义目的:研究原发性卵巢上皮癌组织中Survivin、VEGF、Smac/DIABLO蛋白表达和相互关系,探讨三者在原发性卵巢上皮癌发生、发展中的作用。方法:采用免疫组织细胞化学方法和流式细胞学方法检测Survivin、VEGF、Smac/DIABLO蛋白在检测原发性卵巢上皮癌、良性卵巢上皮肿瘤组织和正常卵巢上皮组织中表达,并分析其与原发性卵巢上皮癌临床生物学行为和预后的关系。结果:1正常卵巢上皮组织、良性卵巢上皮肿瘤组织及原发性卵巢上皮癌组织中Survivin、VEGF、Smac/DIABLO蛋白表达正常和良性组织表达同第一部分。原发性卵巢上皮癌中Survivin、VEGF蛋白表达则均明显增强和Smac/DIABLO蛋白表达明显减弱（P<0.05或P<0.01）;Survivin（胞核、胞浆）、Smac/DIABLO、VEGF蛋白表达阳性率分别为（72.3%、87.2%）、80.9%、91.5%; FI分别为1.10±0.02、0.88±0.08、1.16±0.10。2原发性卵巢上皮癌中Survivin、VEGF、Smac/DIABLO蛋白表达相关性原发性卵巢上皮癌中Survivin胞核与胞浆表达呈正相关性（r=0.514、P<0.01）; Survivin胞浆与Smac/DIABLO的表达间呈负相关性（r=﹣0.312、P<0.05）;Survivin胞浆与VEGF的表达间呈正相关性（r=0.298、P<0.05）;Smac/DIABLO和VEGF的表达间呈负相关性（r=﹣0.320、P<0.05）。3原发性卵巢上皮癌中Survivin、Smac/DIABLO、VEGF蛋白表达与其临床生物学行为（年龄、组织分类、分化、分期、肿瘤大小、腹水、腹水瘤细胞）的关系Survivin胞浆蛋白表达在Ⅲ～Ⅳ期组（胞浆阳性率96.8%; FI=1.10±0.09）明显高于Ⅰ～Ⅱ期（胞浆阳性率68.8%; FI=0.93±0.16）组（P<0.05）。与其他临床生物学行为无关（P>0.05）。Smac/DIABLO蛋白表达在Ⅲ～Ⅳ期组（阳性率71.0%）明显低于Ⅰ～Ⅱ期（阳性率100.0%）组（P<0.05）;在低分化组（阳性率61.9%; FI=0.82±0.07）明显低于中高分化（阳性率96.2%; FI=0.90±0.07）组（P<0.01或P<0.05）。与其他临床生物学行为无关（P>0.05）。VEGF蛋白表达在Ⅲ～Ⅳ期组（FI=1.18±0.09）明显高于Ⅰ～Ⅱ期（FI=1.03±0.02）组（P<0.05）。与其他临床生物学行为无关（P>0.05）。4原发性卵巢上皮癌中Survivin、Smac/DIABLO、VEGF蛋白表达与预后的关系原发性卵巢上皮癌中Survivin胞浆表达阳性患者生存率差于蛋白表达阴性患者（P<0.05）;Smac/DIABLO蛋白表达阳性患者生存率优于蛋白表达阴性患者（P<0.01）; VEGF表达阳性对卵巢上皮癌生存无影响（P>0.05）,而VEGF强表达阳性（3+）患者生存率差于蛋白表达中、弱阳性和阴性患者（P<0.05）,且经Cox多变量回归模型分析证实其是唯一独立的预后因素（P<0.05）。结论:1原发性卵巢上皮癌中Survivin表达明显增强,且与VEGF蛋白表达存在明显正相关,与Smac/DIABLO蛋白表达存在明显负相关,三者相互作用, Survivin、VEGF表达升高和Smac/DIABLO表达降低可能共同参与了卵巢癌生长和转移的过程。2 Survivin存在细胞核、细胞浆不同定位过表达, Survivin胞浆表达可能与原发性卵巢上皮癌发生、发展的关系更密切。3检测Survivin、VEGF、Smac/ DIABLO蛋白水平的表达可以作为判断原发性卵巢上皮癌恶性程度的标志,VEGF过表达可能是原发性卵巢上皮癌唯一独立的预后因素。第三部分Survivin、VEGF、Smac/DIABLO在胃源性及原发性卵巢癌中表达差异研究目的:研究胃源性卵巢转移癌及原发性卵巢上皮癌中Survivin、VEGF、Smac/DIABLO蛋白表达差异,探讨这三个指标在卵巢转移癌及原发卵巢上皮癌发生、发展中的作用和鉴别诊断价值。方法:采用免疫组织细胞化学和流式细胞学方法检测Survivin、VEGF、Smac/DIABLO蛋白在胃源性卵巢转移癌、原发性卵巢上皮癌、良性卵巢上皮肿瘤组织和正常卵巢上皮组织中表达差异。结果:正常和良性组织表达同第一部分。胃源性卵巢转移癌中Survivin、VEGF蛋白表达均明显增强和Smac/DIABLO蛋白表达明显减弱（P<0.05或P<0.01）;胃源性卵巢转移癌组织中Survivin（胞核、胞浆）、Smac/DIABLO、VEGF蛋白表达阳性率分别为（100.0%、90.3%）、77.4%、90.3%;FI分别为1.10±0.09、0.84±0.08和1.12±0.11;原发性卵巢上皮癌组织中Survivin、VEGF蛋白表达则均明显增强和Smac/DIABLO蛋白表达明显减弱（P<0.05或P<0.01）;Survivin（胞核、胞浆）、Smac/DIABLO、VEGF蛋白表达阳性率分别为（72.3%、87.2%）、80.9%、91.5%; FI分别为1.10±0.02、0.88±0.08、1.16±0.10。其中Survivin胞核表达在胃源性卵巢转移癌明显高于原发性卵巢上皮癌（P<0.01）;而Survivin胞浆表达及VEGF、Smac/DIABLO蛋白表达较原发性卵巢上皮癌无明显差异（P>0.05）。结论:1 Survivin、VEGF、Smac/ DIABLO在胃源性卵巢转移癌及原发性卵巢上皮癌的形成中可能均起重要作用,Survivin和VEGF蛋白表达升高和Smac/DIABLO蛋白表达降低可能共同参与了其发生和发展。2 Survivin细胞核表达在胃源性卵巢转移癌与原发性卵巢上皮癌中存在显著差异,Survivin细胞核表达可能作为两者鉴别的指标。第四部分Survivin反义寡核苷酸对卵巢癌及胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响目的:探讨脂质体介导Survivin反义寡核苷酸（Survivin ASODN）在人卵巢上皮癌SKOV3细胞和胃低分化癌BGC-823细胞的转染效率及对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响方法:以Survivin mRNA232-251区为靶点合成Survivin反义寡核苷酸,脂质体介导转染人卵巢癌SKOV3细胞和胃癌BGC-823细胞,共聚焦显微镜和FCM观察转染效率,MTT检测细胞增殖的改变,FCM检测细胞周期和凋亡的改变,Transwell小室法观察细胞迁移和侵袭能力的改变。结果:1人卵巢癌SKOV3细胞转染率Survivin ASODN（ug）:LipofectamineTM2000 （ul）最佳比例为:1:1.5。经脂质体介导转染后,荧光颗粒大部分位于细胞核中,FCM法测定6h转染率达>95%。2 Survivin ASODN对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响2.1 MTT法观察Survivin ASODN对SKOV3细胞增殖抑制作用Survivin ASODN对SKOV3细胞增殖抑制均呈剂量和时间依存关系（P<0.05或P<0.01）,不同浓度Survivin SODN组和脂质体组均对SKOV3细胞增殖无抑制作用（p>0.05）。600nm/L Survivin ASODN转染48小时细胞存活率为49.5±20.76%,接近IC50值。2.2 FCM法观察Survivin ASODN对SKOV3细胞生长周期、凋亡的影响Survivin ASODN转染组SKOV3细胞的调亡指数（ AI ）为28.67±3.29%,较脂质体空白对照组5.48±1.55%明显升高（t=6.367, p <0.05）。Survivin ASODN转染组G0/G1期细胞比例（42.7±1%）较脂质体空白对照组（30.85±0.55%）明显升高,两者比较有显著性差异（t=10.383, p <0.01）。2.3Transwell小室法观察Survivin ASODN对SKOV3细胞迁移和侵袭能力的影响Survivin ASODN转染组SKOV3细胞的迁移率由脂质体空白对照组的66.57±2.11%下降至57.87±1.34%（t =3.474,p<0.05）;迁移细胞数由脂质体空白对照组的189.67±1.53下降至115.33±6.5（1t =19.264,p<0.01）。Survivin ASODN转染组SKOV3细胞的侵袭率由脂质体空白对照组的22.27±0.58%下降至14.6±1.21%,（t = 5.718,p<0.01）;侵袭细胞数由脂质体空白对照组的113.33±2.08下降至75.67±1.15（t =27.416,p<0.01）。3人胃癌BGC-823细胞转染率Survivin ASODN（ug）:LipofectamineTM2000 （ul）最佳比例为:1:2,经脂质体介导转染后,荧光颗粒大部分位于细胞核中,FCM法测定6h转染率达>90%。4 Survivin ASODN对胃癌BGC-823细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响4.1 MTT法观察Survivin ASODN对BGC-823细胞增殖抑制作用Survivin ASODN对BGC-823细胞增殖抑制均呈剂量和时间依赖性（P<0.05或P<0.01）,不同浓度Survivin SODN组和脂质体组均对BGC-823细胞增殖无抑制作用（p>0.05）。600nm/L ASODN转染48小时细胞存活率为46.75±4.99%,接近IC50值。4.2 FCM法观察Survivin ASODN对BGC-823细胞生长周期、凋亡的影响Survivin ASODN转染组BGC-823细胞的调亡指数（ AI ）为11.31±0.38%,较脂质体空白对照组1.62±0.36%明显升高（t=18.512, p <0.01）。Survivin ASODN转染组G0/G1期细胞比例（72.25±2.95%）较脂质体空白对照组（56.25±0.75%）明显升高,两者比较有显著性差异（t= 5.257, p <0.05）; Survivin ASODN转染组G2/M期细胞比例（1.75±0.17%）较脂质体空白对照组（13.4±0.05%）降低,两者比较有显著性差异（t=67.717, p <0.01）。4.3 Transwell小室法观察Survivin ASODN对BGC-823细胞迁移和侵袭能力的影响Survivin ASODN转染组BGC-823细胞的迁移率由脂质体空白对照组的67.97±2.21%下降至54.53±2.13%,（t =4.378,p<0.05）;迁移细胞数由脂质体空白对照组的140.67±1.53下降至74.33±2.08（t =44.498,p<0.01）。Survivin ASODN转染组BGC-823细胞的侵袭率由脂质体空白对照组的27.3±0.57%下降至19.2±0.66%,（t = 9.332, p<0.01）;侵袭细胞数由脂质体空白对照组的97.33±4.04下降至59.33±5.69,（t = 9.435,p<0.01）。结论:1 Survivin可能与卵巢癌和胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力密切相关。2 Survivin ASODN可明显抑制卵巢癌和胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭,因而可能成为晚期、转移性和复发卵巢癌有效治疗手段。第五部分Survivin反义寡核苷酸对卵巢癌及胃癌细胞Survivn、VEGF、Smac/DIABLO表达的影响目的:探讨Survivin反义寡核苷酸（Survivin ASODN）对人卵巢癌SKOV3细胞和胃癌BGC-823细胞Survivn、VEGF、Smac/DIABLO基因和蛋白表达的影响和意义。方法:脂质体介导Survivin ASODN转染人卵巢癌SKOV3细胞和胃癌BGC-823细胞,半定量RT-PCR检测转染后细胞Survivn、VEGF、Smac/DIABLO mRNA水平表达变化,FCM检测Survivn、VEGF、Smac/DIABLO蛋白水平表达变化。结果:1 Survivin ASODN对卵巢癌SKOV3细胞Survivn、VEGF、Smac/DIABLO mRNA表达的影响对照组SKOV3细胞的Survivn mRNA、VEGF mRNA、Smac/DIABLO mRNA积分光密度（IA）比值（Survivn/β-actin、VEGF/β-actin、Smac/β-actin）分别为:0.81±0.07、0.35±0.04、0.59±0.28;Survivin ASODN转染组SKOV3细胞的Survivn mRNA、VEGF mRNA、Smac/DIABLO mRNA IA比值分别为:0.45±0.07、0.23±0.03、1.66±0.26。Survivin ASODN作用后细胞的Survivn及VEGF基因表达明显低于对照组细胞（t = 3.503,p<0.05;t =2.539,p<0.05）;而Smac/DIABLO基因表达明显高于对照组细胞（t = -2.801,p<0.05）。2 Survivin ASODN对卵巢癌SKOV3细胞Survivn、VEGF、Smac/DIABLO蛋白表达的影响对照组SKOV3细胞的Survivn、VEGF、Smac/DIABLO蛋白FI值分别为:1.00±0.03、1.00±0.03、0.99±0.07;Survivin ASODN转染组SKOV3细胞的Survivn、VEGF、Smac/DIABLO蛋白FI值分别为:0.64±0.04、0.59±0.03、1.91±0.03。Survivin ASODN作用后细胞的Survivn、VEGF蛋白表达明显低于对照组细胞（t = 7.815,p<0.05;t = 33.837,p<0.01）;而Smac/DIABLO蛋白表达明显高于对照组细胞（t = 11.392,,p<0.01）。3 Survivin ASODN对卵巢癌BGC-823细胞Survivn、VEGF、Smac/DIABLO mRNA表达的影响对照组BGC-823细胞的Survivn mRNA、VEGF mRNA、Smac/DIABLO mRNA IA比值分别为:0.86±0.05、0.78±0.06、0.56±0.04;Survivin ASODN转染组BGC-823细胞的Survivn mRNA、VEGF mRNA、Smac/DIABLO mRNA IA比值分别为:0.52±0.09、0.52±0.08、0.90±0.11。Survivin ASODN作用后细胞中的Survivn及VEGF基因表达明显低于对照组细胞（t = 3.294,p<0.05;t = 2.700,p<0.05）;而Smac/DIABLO基因表达明显高于对照组细胞（t = -2.832,p<0.05）。4 Survivin ASODN对卵巢癌BGC-823细胞Survivn、VEGF、Smac/DIABLO蛋白表达的影响对照组BGC-823细胞的Survivn、VEGF、Smac/DIABLO蛋白FI值分别为:0.99±0.02、1.00±0.01、1.00±0.05;Survivin ASODN转染组BGC-823细胞的Survivn、VEGF、Smac/DIABLO蛋白FI值分别为:0.73±0.01、0.75±0.01、1.64±0.02。Survivin ASODN作用后细胞的Survivn、VEGF蛋白表达明显低于对照组细胞（t = 10.557 p<0.01;t = 21.651,p<0.01）;而Smac/DIABLO蛋白表达高于对照组细胞（t =11.667,p<0.01）。结论:Survivin ASODN不仅可直接抑制survivin表达,还可能直接和/或间接抑制VEGF表达和上调Smac/DIABLO表达,三者共同作用,使Survivin ASODN可能在防治卵巢癌和胃癌生长、转移和复发过程中发挥作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 Survivin对胃源性及原发性卵巢癌生物学行为影响的实验研究
• 引言
• 第一部分 Survivin、VEGF、Smac/DIABLO 在胃源性卵巢转移癌中表达和意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 Survivin、VEGF、Smac/DIABLO 在原发性卵巢上皮癌中表达和意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 Survivin、VEGF、Smac/DIABLO 在胃源性及原发性卵巢癌中表达差异研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四部分 Survivin 反义寡核苷酸对卵巢癌及胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第五部分 Survivin 反义寡核苷酸对卵巢癌及胃癌细胞Survivn、VEGF、Smac/DIABLO 表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述 Survivin 与恶性肿瘤生物学行为关系的研究进展
• 致谢
• 个人简历