一种鸭肉磷脂酶的分离纯化和酶学性质研究

论文摘要

南京板鸭是中国传统的腌腊肉制品之一,具有悠久的历史和独特的风味。众多学者的研究都证实腌腊肉制品特有的风味与脂类物质尤其是磷脂的降解有关,而磷脂的变化与磷脂水解酶系的作用密不可分。曾有学者从宏观角度在腌腊肉制品加工过程中跟踪过磷脂水解酶系的活力变化,这就更进一步肯定了磷脂水解酶系在腌腊肉制品风味形成中的地位,因此研究磷脂水解酶系在肉制品加工过程中的活性变化与作用机制,对于深入了解腌腊肉制品生产过程中脂类物质的变化机理,揭示脂类物质变化与风味形成之间的关系具有重要的意义。目前只有少部分研究者检测过南京板鸭生产过程中总磷脂酶的活力,但从原材料中将磷脂水解酶系提取出来并深入到分子水平去研究腌腊肉制品中磷脂水解酶系的作用机制的相关资料却极少。本课题首次通过结合Source15Q离子交换层析法和Superdex200凝胶层析法从新鲜鸭肉中分离纯化得到一种具有磷脂酶A2活性的磷脂水解酶,并初步研究了这种酶的部分酶学性质,为南京板鸭风味形成的机理研究、加工过程的调控以及传统工艺的改进提供理论依据。具体研究内容和结果如下：（1）鸭肉磷脂粗酶液的提取及酶活分析。以鸭股二头肌为原料,优化了鸭肉肌内磷脂水解酶的提取过程并检测了各种鸭肉肌内磷脂水解酶的酶活（酸性脂肪酶、中性脂肪酶、总磷脂酶、磷脂酶A2、磷脂酶C和磷脂酶D）。结果显示,鸭股二头肌磷脂酶A2活性远高于胸脯肉；股二头肌中磷脂酶A2的活性远高于其他磷脂水解酶的活性；肌内磷脂水解酶提取缓冲液0.1mol·L-1Tris-HCl的最佳pH为8.0,最佳盐析条件为70%饱和度的硫酸铵溶液。（2）分离纯化鸭肉磷脂酶A2。以上述获得的粗酶液为原料,本实验首先尝试使用Source15Q（1.5×5.5cm）离子交换层析进行纯化,并对离子交换层析的条件进行优化,最终确定为pH8.0,50mmol·L-1Tris-HCl为A相,含1mol·L-1NaCl的pH8.0,50mmol·L-1Tris-HCl为B相,平衡流速为1.0ml·min-1,洗脱流速为1.5ml·min-1,35min达到100%B,上样量为500μ1。然后将得到的活性峰再次上样于Superdex200（1.0×30cm）凝胶层析,最终经SDS-PAGE证实,获得了一种电泳的具有磷脂酶A2活性的磷脂水解酶,并通过薄层析法和液相色谱法证实了这种酶的活性。（3）部分酶学性质的初步研究。SDS-PAGE电泳测得该具有磷脂酶A2活性的磷脂水解酶的表观分子量约为82.3KDa；通过研究该种酶的基本酶学性质发现,NaF对其活性酶液没有抑制作用,所以这肯定不是脂肪酶,这种磷脂酶A2的最适反应温度为25℃,最适反应pH为7.5,Ca2+对该酶的活性基本没有影响,纯化的酶液经超滤浓缩后在4℃下可以保存最佳时间约为3d,若要长期保存,则需要将浓缩后的酶液冷冻干燥后再保存。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 概述
• 1.2 酶活检测方法
• 1.2.1 同位素法
• 1.2.2 荧光法
• 1.2.3 分光光度法
• 1.2.4 滴定法
• 1.2.5 其他
• 1.3 四种酶提取纯化方法
• 2'>1.3.1 PLA₂
• 1.3.2 PLC
• 1.3.3 PLD
• 1.4 磷脂水解酶系在腌腊肉制品加工中的作用规律
• 1.4.1 腌腊肉制品中磷脂水解酶系的作用底物—脂类物质的组成与变化
• 1.4.2 腌腊肉制品中主要的磷脂水解酶系的分类与作用特点
• 1.4.3 内源脂肪酶系在腌腊肉制品加工过程中的活性变化
• 1.5 选题依据和研究意义
• 参考文献
• 第二章 ：鸭肉肌内磷脂水解酶的提取及相关酶系的酶活测定
• 2.1 试验材料与仪器
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试剂及仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 肌内磷脂水解酶的提取
• 2.2.2 原料的选择
• 2.2.3 透析脱盐
• 2.2.4 粗酶提取的条件优化
• 2.2.5 酶活力的测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 原料的选择
• 2.3.2 粗提缓冲液Tris-HCl的pH确定
• 2.3.3 盐析条件的优化
• 2.3.4 透析所得粗酶液中相关酶系的活力
• 2.4 讨论
• 2.4.1 肌内磷脂水解酶提取条件的选择
• 2.4.2 肌内磷脂水解酶液中磷脂水解酶的活力
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 2的分离纯化'>第三章 ：磷脂酶A₂的分离纯化
• 3.1 试验材料和仪器
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试剂及仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 粗分离
• 2活力测定'>3.2.2 磷脂酶A₂活力测定
• 3.2.3 蛋白浓度的测定
• 2的分离纯化制备'>3.2.4 磷脂酶A₂的分离纯化制备
• 3.2.5 酶的浓缩和保存
• 3.2.6 微乳底物的配制
• 3.2.7 薄层析和高效液相色谱法鉴定酶活
• 3.2.8 SDS-PAGE
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 阳离子交换
• 3.3.2 凝胶层析
• 2的纯化过程总结'>3.3.3 磷脂酶A₂的纯化过程总结
• 3.3.4 酶活鉴定
• 3.3.5 纯度鉴定
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 2酶学性质的初步研究'>第四章 ：磷脂酶A₂酶学性质的初步研究
• 4.1 试验材料和仪器
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试剂及仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 酶活测定
• 4.2.2 分子量的测定
• 2活性的影响'>4.2.3 温度对磷脂酶A₂活性的影响
• 2活性的影响'>4.2.4 pH对磷脂酶A₂活性的影响
• 2+对磷脂酶A₂活性的影响'>4.2.5 Ca²⁺对磷脂酶A₂活性的影响
• 2活性的影响'>4.2.6 NaF对磷脂酶A₂活性的影响
• 2的热稳定性'>4.2.7 磷脂酶A₂的热稳定性
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 分子量的测定
• 2活性的影响'>4.3.2 温度对磷脂酶A₂活性的影响
• 2活性的影响'>4.3.3 pH对磷脂酶A₂活性的影响
• 2+对磷脂酶活性的影响'>4.3.4 Ca²⁺对磷脂酶活性的影响
• 4.3.5 NaF对磷脂酶活性的影响
• 2的热稳定性'>4.3.6 磷脂酶A₂的热稳定性
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 ：全文总结和展望
• 5.1 研究总结
• 5.2 论文的创新点
• 5.3 展望
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文目录