作物枯萎病生防细菌的研究

论文摘要

枯萎病是一种毁灭性的土传病害，该病的生物防治已受到世界各国的极大关注。为获得优良性状生防菌直接为生产服务，本论文从菌种筛选鉴定、抑菌机理、安全性、发酵条件、定殖状况、抑菌物质分离提纯等方面对枯萎病的生防细菌进行了较系统的研究。以番茄枯萎病病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici）为靶标菌，通过平板拮抗和温室盆栽防效相结合的方法从不同来源的土壤中筛选具有生防潜力的芽孢杆菌。从分离到的169株芽孢杆菌中筛选出具有拮抗作用的菌株15个，其中JK-2菌株对番茄枯萎病的盆栽防效和田间防效分别达到83.82％和74.70％，抑菌能力最强。通过生理生化特征和16S rDNA序列比较、脂肪酸（FAME）分析，JK-2菌株被鉴定为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）。电镜观察结果表明，JK-2主要通过拮抗作用来抑制枯萎病菌在番茄根部的侵染。JK-2可造成枯萎病菌菌丝消解、产生泡状物、破坏生长点、引起细胞内含物外溢及降低孢子萌发率。JK-2对寄主植物没有致病性；对小白鼠的半致死量LD50＞2000mg·kg-1；接种JK-2菌株30d后，番茄根际土壤中细菌和放线菌数量的变化均末达到极显著水平，而真菌数量明显下降，初步表明了该菌株安全性较高，符合生物杀菌剂的要求。通过正交优化试验获得的最适宜JK-2抑菌物质产生的发酵配方为：淀粉1.0％、牛肉膏0.5％、蛋白胨03％、蔗糖1.0％、酵母粉0.5％，CaCl20.5％，初始pH7.0。JK-2产生的抑菌物质粗提物对蛋白酶不敏感，耐强酸强碱，紫外线和反复冻融对其活性也没有显著影响。在定殖试验中成功获得了具GFP标记和红霉素抗性的转化子JK-2-gfp，JK-2-gfp菌株可通过灌根接种的方法在自然土壤中成功定殖，其在土壤中的含量为104-106cfu／g，接种60天后仍可在士壤中分离到JK-2-gfp菌株。本试验从JK-2发酵液中提取出了分子量约为4.1kD的活性肽和具有抑制枯萎菌活性的胞外多糖，短短芽孢杆菌产生对病原真菌具拮抗活性的多糖物质在国内外尚属首次报道。本研究同时对福建漳州香蕉植株的内生细菌进行了分离和拮抗细菌的筛选。首次在国内开展了香蕉健康植株和罹患枯萎病植株中内生细菌分布规律的比较研究。统计分析结果表明，健株体内细菌总量显著高于病株；健株中除地下球茎、叶柄部位的内生细菌数量与病株相比不存在显著差异外，其余各部位的内生细菌数量均显著高于病株；健株和病株内生细菌在种群数量分布上存在差异；分离到的16个内生细菌种群中，在健株中没有分离到巨大芽孢杆菌（B. megaterium），而在病株中没有分离到Acinetobacter baumannii和Microbacterium chocolatum。从分离到的411株香蕉内生细菌中筛选出35株对尖孢镰刀菌香蕉专化型（F. oxysporum f. sp. cubense）具有抑制作用的拮抗细菌，占供试菌株总数的8.52％。最后筛选到的8株能够产生稳定抑菌圈的菌株中有6株分离自健康植株，经鉴定有5株为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、2株为恶臭假单胞菌（P. putida）、1株为生枝动胶菌（Zoogloea ramigera），其中铜绿假单胞菌H4-3-1菌株抑菌活性最强。抑菌谱试验结果表明H4-3-1菌株对番茄、香蕉、西瓜、甜瓜、辣椒枯萎病病原菌、番茄灰霉菌、油菜菌核菌等均有良好的离体拮抗效果。电镜观察结果表明，H4-3-1菌株能使番茄枯萎菌菌丝扭曲变形、细胞壁破裂、纠集成团停止生长，但对孢子萌发的抑制作用不大。H4-3-1菌株代谢产物可显著促进胚轴和根的生长，在盆栽试验中，H4-3-1菌悬液对番茄出苗具有显著的促进作用，对番茄苗株高、根长和鲜重也有不同程度的促进作用。由于H4-3-1菌株菌体数量与抑菌活性不呈正相关，需考虑实际需要来选择发酵条件，其中抑菌活性物质产生的最佳培养条件为：NA培养液初始pH为7.0，装液量25ml／250ml三角瓶，30℃下振荡培养24h。H4-3-1产生的抑菌物质可以被饱和度为70％的硫酸铵完全沉淀下来，初步判断该物质为大分子蛋白，该物质具有耐热、耐酸碱、耐蛋白酶、耐紫外线等特点，具有研究开发的价值。通过对H4-3-1进行抗Rif突变株筛选，得到能在含350μg／mlRif的NA固体培养基上稳定生长的突变菌株用于定殖试验。H4-3-1菌株通过浸种、灌根等体外接种方法均可进入其自然寄主香蕉和非自然寄主番茄、西瓜、甜瓜等植株体内定殖或短时间定殖，表明H4-3-1没有寄主专一性的限制，具有较为广泛的寄主。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1.枯萎病的生物防治研究进展
• 2.拮抗细菌在植物土传病害生物防治中的应用
• 3.细菌作为生防因子存在的问题及应用前景
• 4.论文设计思路
• 第一章 作物枯萎病生防细菌的资源筛选
• 第一节 土壤及植物根部拮抗芽孢杆菌的分离筛选鉴定
• 1.1.1 材料与方法
• 1.1.1.1 供试材料
• 1.1.1.2 培养基
• 1.1.1.3 试剂
• 1.1.1.4 芽孢杆菌的分离
• 1.1.1.5 拮抗细菌的筛选
• 1.1.1.6 拮抗细菌的鉴定
• 1.1.2 结果与分析
• 1.1.2.1 芽孢杆菌的分离结果
• 1.1.2.2 平板对峙培养法筛选结果
• 1.1.2.3 琼脂扩散法筛选结果
• 1.1.2.4 苗期盆栽试验筛选结果
• 1.1.2.5 田间小区试验结果
• 1.1.2.6 拮抗细菌的鉴定结果
• 1.1.3 讨论
• 第二节 内生细菌在香蕉体内的分布及枯萎病拮抗细菌的筛选鉴定
• 1.2.1 材料和方法
• 1.2.1.1 供试材料
• 1.2.1.2 内生细菌的分离
• 1.2.1.3 内生细菌在香蕉植株内的分布
• 1.2.1.4 对枯萎病菌具有拮抗活性的内生细菌的筛选
• 1.2.1.5 内生细菌的鉴定
• 1.2.1.6 优势菌及拮抗菌的内生性回接测定
• 1.2.2 结果与分析
• 1.2.2.1 内生细菌的分布
• 1.2.2.2 内生细菌的种群组成及分布
• 1.2.2.3 内生细菌在微生境中数量分布的主分量分析
• 1.2.2.4 对枯萎病菌具有拮抗活性的内生细菌的筛选
• 1.2.2.5 对枯萎病菌具有拮抗活性的内生细菌的鉴定
• 1.2.2.6 拮抗菌的内生性回接测定结果
• 1.2.3 讨论
• 第二章 作物枯萎病生防细菌的抑菌谱、作用机理及风险评估
• 第一节 短短芽孢杆菌JK-2的抑菌谱、作用机理及风险评估
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.1.1 供试材料
• 2.1.1.2 抑菌谱测定
• 2.1.1.3 JK-2对番茄枯萎病菌的抑制作用
• 2.1.1.4 JK-2与番茄枯萎病菌在番茄根部伤口的互作
• 2.1.1.5 JK-2菌株对番茄的促生作用
• 2.1.1.6 生防菌株JK-2生物安全性评价
• 2.1.2 结果与分析
• 2.1.2.1 JK-2抑菌谱测定结果
• 2.1.2.2 JK-2对番茄枯萎病菌的抑制作用
• 2.1.2.3 JK-2与番茄枯萎病菌在番茄根部伤口的互作
• 2.1.2.4 JK-2菌株对番茄生长的影响
• 2.1.2.5 生防菌株JK-2生物安全性评价
• 2.1.3 讨论
• 第二节 铜绿假单胞菌H4-3-1的抑菌谱、作用机理及风险评估
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.1.1 供试材料
• 2.2.1.2 抑菌谱测定
• 2.2.1.3 H4-3-1对番茄枯萎病菌菌丝生长的影响
• 2.2.1.4 H4-3-1代谢产物对番茄枯萎病菌的抑制作用
• 2.2.1.5 H4-3-1菌株对番茄的促生作用
• 2.2.1.6 H4-3-1菌株致病性测定
• 2.2.1.7 H4-3-1菌株对小白鼠的急性毒性反应
• 2.2.2 结果与分析
• 2.2.2.1 抑菌谱测定结果
• 2.2.2.2 H4-3-1对番茄枯萎病菌菌丝生长的影响
• 2.2.2.3 H4-3-1代谢产物对番茄枯萎病菌的抑制作用
• 2.2.2.4 H4-3-1菌株对番茄生长的影响
• 2.2.2.5 H4-3-1菌株致病性测定
• 2.2.2.6 H4-3-1菌株对小白鼠的急性毒性反应
• 2.2.3 讨论
• 第三章 作物枯萎病生防细菌抑菌物质产生条件的优化
• 第一节 短短芽孢杆菌JK-2抑菌物质产生条件的优化
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.1.1 材料
• 3.1.1.2 抑菌活性、发酵液菌体数的测定
• 3.1.1.3 培养基营养成分的优化
• 3.1.1.4 培养条件的优化
• 3.1.1.5 发酵过程的代谢变化
• 3.1.2.结果与分析
• 3.1.2.1 培养基营养成分的优化结果
• 3.1.2.2 培养条件的优化结果
• 3.1.2.3 发酵过程的代谢变化
• 3.1.3 讨论
• 第二节 铜绿假单胞菌H4-3-1菌株发酵条件的优化
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.1.1 材料
• 3.2.1.2 种子液的培养
• 3.2.1.3 培养时间对菌株生长及抑菌活性的影响
• 3.2.1.4 培养温度对菌株生长及抑菌活性的影响
• 3.2.1.5 培养基初始pH值对菌株生长及抑菌活性的影响
• 3.2.1.6 装液量对菌株生长及抑菌活性的影响
• 3.2.1.7 菌量计数和拮抗活性测定
• 3.2.2 结果与分析
• 3.2.2.1 标准曲线的绘制
• 3.2.2.2 培养时间对菌株生长及抑菌物质产生的影响
• 3.2.2.3 培养温度对菌株生长及抑菌物质产生的影响
• 3.2.2.4 培养基初始pH值对菌株生长及抑菌物质产生的影响
• 3.2.2.5 装液量对菌株生长及抑菌物质产生的影响
• 3.2.3 讨论
• 第四章 作物枯萎病生防细菌抑菌物质的初步研究
• 第一节 短短芽孢杆菌JK-2菌株抑菌物质的初步研究
• 4.1.1 材料和方法
• 4.1.1.1 材料
• 4.1.1.2 抑菌物质粗提物的制备及抑菌活性测定
• 4.1.1.3 抑菌物质粗提物稳定性的测定
• 4.1.1.4 抑菌物质的分离纯化流程
• 4.1.1.5 有机溶剂萃取物制备及其抑菌活性
• 4.1.1.6 抑菌蛋白成分的提取
• 4.1.1.7 胞外多糖的提取
• 4.1.1.8 表面活性素的提取
• 4.1.1.9 菌体内毒素的提取
• 4.1.2 结果与分析
• 4.1.2.1 JK-2抑菌物质粗提液稳定性测定
• 4.1.2.2 有机溶剂萃取物抑菌活性
• 4.1.2.3 抑菌蛋白成分提取
• 4.1.2.4 胞外多糖的提取
• 4.1.2.5 表面活性素和菌体内毒素的提取
• 4.1.3 讨论
• 第二节 内生拮抗细菌抑菌物质特性的初步研究
• 4.2.1 材料与方法
• 4.2.1.1 供试菌株
• 4.2.1.2 胞外蛋白的提取及活性测定
• 4.2.1.3 铜绿假单胞菌菌株所产抑菌蛋白的电泳检测
• 4.2.1.4 H4-3-1菌株所产抑菌蛋白稳定性测定
• 4.2.2 结果与分析
• 4.2.2.1 胞外蛋白的提取及活性测定
• 4.2.2.2 铜绿假单胞菌菌株所产抑菌蛋白的电泳检测
• 4.2.2.3 H4-3-1菌株所产抑菌蛋白稳定性测定结果
• 4.2.3 讨论
• 第五章 作物枯萎病生防细菌定殖规律的研究
• 第一节 短短芽孢杆菌JK-2菌株定殖规律的研究
• 5.1.1 材料与方法
• 5.1.1.1 材料
• 5.1.1.2 质粒提取方法
• 5.1.1.3 JK-2感受态细胞的制备
• 5.1.1.4 电击转化
• 5.1.1.5 转化子的荧光检测
• 5.1.1.6 标记菌株遗传稳定性的测定
• 5.1.1.7 标记菌株的生长动力学
• 5.1.1.8 标记菌株抑菌活性检测
• 5.1.1.9 JK-2在番茄根际土壤及植株体的定殖
• 5.1.2 结果与分析
• 5.1.2.1 电转化法获得阳性转化子及转化子的荧光检测
• 5.1.2.2 标记菌株遗传稳定性的测定
• 5.1.2.3 标记菌株的生长动力学
• 5.1.2.4 标记菌株抑菌活性检测
• 5.1.2.5 浸种处理后JK-2-gfp在番茄根际土壤及植株体的定殖动态
• 5.1.2.6 灌根处理后JK-2在番茄根际土壤及植株体的定殖动态
• 5.1.3 讨论
• 第二节 铜绿假单胞菌H4-3-1菌株内生定殖规律研究
• 5.2.1 材料与方法
• 5.2.1.1 材料
• 5.2.1.2 H4-3-1抗利福平（Rif）突变菌株的筛选及菌悬液的制备
• 5.2.1.3 H4-3-1菌株内生寄主范围测定
• 5.2.1.4 影响H4-3-1在香蕉体内定殖的因素
• 5.2.1.5 H4-3-1菌株在室内盆栽香蕉和番茄体内的定殖动态
• 5.2.1.6 定殖菌的回收和鉴定
• 5.2.2 结果与分析
• 5.2.2.1 H4-3-1抗利福平（Rif）突变菌株的筛选及其稳定性测定
• 5.2.2.2 H4-3-1菌株内生寄主范围
• 5.2.2.3 影响H4-3-1在香蕉根内定殖的因素
• 5.2.2.4 灌根处理后H4-3-1菌株在香蕉和番茄体内的定殖动态
• 5.2.2.5 定殖菌的回收和鉴定
• 5.2.3 讨论
• 结论与展望
• 一、结论
• 二、下一步研究打算
• 参考文献
• 致谢
• 附录:攻读博士期间发表论文