Toll样受体激动剂和RNA干预技术对HPV 6b/11型感染的抑制作用研究

论文摘要

尖锐湿疣（Condyloma acuminatum,CA）是我国发病率最高的性传播疾病之一,临床上顽固难治,极易复发,严重危害患者的身心健康,寻求理想的治疗和预防手段迫在眉睫。人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）是尖锐湿疣的病原体,其中6型和11型是CA的主要致病型别,相对于肿瘤相关的高危型HPV,主要感染皮肤和外生殖器粘膜,被称为低危型或皮肤型HPV。HPV感染常不能有效激发机体免疫应答以清除病毒感染,是HPV感染难治的主要原因。如何有效抑制病毒复制,激发机体特异性抗HPV免疫应答是控制或清除HPV感染的关键。HPV早期基因E7是主要致病基因之一,可引起宿主细胞增殖周期改变,并下调抑癌基因表达,诱导细胞恶性转化,因而是HPV感染防治研究的理想靶点。本研究以E7基因或蛋白为研究基础,从调节宿主抗病毒特异性细胞免疫、和特异性沉默主要致病基因两个方面进行HPV感染的干预实验,以期为CA等低危型HPV感染相关疾病的防治研究提供一定的实验依据。Toll样受体（Toll like receptors,TLRs）能特异性识别病原微生物进化过程中保守的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）,启动天然免疫应答并继而激活获得性免疫反应。通过激活某些TLR信号通路,可促进Th0细胞（Th,T helper,辅助性T细胞）向Th1分化,调节T细胞亚群Th1/Th2、Tc1/Tc2的平衡,促进抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL,Tc）的活性,有利于病毒感染细胞的清除。本研究以人外周血单核细胞来源的树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells,mdDCs）负载HPV 11 E7抗原HLA-A*0201限制性CTL优势表位肽（以下简称E7多肽）,以不同TLR激动剂诱导其成熟,分析其对mdDCs的表型、细胞因子分泌水平及其对T淋巴细胞的活化作用的影响。结果显示,所研究的TLR激动剂均能促进mdDCs功能分化及成熟,促进负载E7多肽的mdDCs（以下简称E7-mdDCs）分泌IL-12,尤以TLR3的激动剂聚肌胞苷酸（polyinosinicacid-polycytidylic acid,PIC）和TLR4的激动剂脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激作用最强,而TLR7的激动剂咪喹莫特及TLR9的激动剂胞嘧啶鸟嘌呤核苷酸序列（cytidylyl phosphate guanosine oligoneuleotid,CpG ODN）的作用相对较弱。PIC诱导的E7-mdDCs能促使CD4+初始T细胞分泌高水平IFN-γ,作用明显强于LPS、咪喹莫特及CpG ODN组。此外,LPS和PIC诱导的E7-mdDCs可提高T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α的水平以及分泌IFN-γ、IL-2的T淋巴细胞频数,并显著增强E7特异性CTL活性,作用明显高于另两个激动剂咪喹莫特和CpG ODN。结果提示TLR激动剂可上调HPV11 E7 CTL表位肽诱导的特异性免疫应答,进而有利于控制或清除HPV 11型感染细胞。而在进一步基于mdDCs的多肽疫苗研究中,TLR3和TLR4的激动剂可能成为有效的疫苗佐剂。特异性HPV疫苗在预防HPV感染方面显示了高保护率,但对于免疫抑制的患者仍效果不佳,因为它们在这类患者体内仍无法激发有效的免疫保护应答,因而可能需从清除病毒本身的角度来进行干预。RNA干扰（RNA interference,RNAi）指双链RNA在生物细胞内对序列特异性mRNA表达的抑制作用,具特异性和高效性,因而作为一种重要的基因沉默技术被广泛应用于基因功能研究及疾病机制和防治研究中。本文在表达HPV6b或11型E7基因的小鼠黑素瘤细胞株BL6-B16和小鼠荷瘤模型中研究siRNA（small interfering RNA）和shRNA（small hairpin RNA）质粒表达载体对HPV基因早期基因E6、E7表达的沉默作用。特异性siRNA二聚体或shRNA质粒表达载体分别转染靶细胞HPV6bE7/B16和HPV11E7/B16,分析其在转染后不同时间、及不同转染剂量下对细胞内靶基因mRNA表达的影响。表达HPV6b或11型E7基因的荷瘤小鼠模型则以瘤内注射或尾静脉注射法导入阳离子脂质体负载的siRNA或shRNA质粒表达载体,注射3次后检测肿瘤组织内靶基因mRNA的表达。检测方法为实时荧光定量PCR。体外实验结果表明,siRNA及shRNA质粒表达载体均可在体外高效特异地抑制HPV6b和11型E7基因的表达,且其干预作用存在一定的量效性和时效性。SiRNA- HPV6b/11 E7的最佳作用浓度为25-50 nmol/L,shRNA质粒表达载体pU6-sh6b/11 E7的最佳作用浓度为0.2-0.4μg/ml,靶基因表达抑制率均于72h达到最高（60%-80%）,抑制效果可持续96h。动物实验结果表明,siRNA及shRNA质粒表达载体分别以瘤内注射或尾静脉注射法导入小鼠模型,可明显抑制肿瘤内E7基因的表达,且瘤内注射较尾静脉注射效果更明显,瘤内注射对靶基因表达的抑制效率可达50%以上。结果提示siRNA及shRNA质粒表达载体在体外培养细胞及小鼠体内均可有效特异地抑制HPV6b/11 E7基因的表达,提示RNAi技术可通过对HPV6b/11 E7基因的特异性沉默干预HPV6b/11病毒蛋白的合成、抑制蛋白功能进而影响病毒复制乃至病毒播散。该技术将有利于CA等低危型HPV感染疾病的控制。结论:本研究不仅提示TLR激动剂（尤其是TLR3的激动剂PIC和TLR4的激动剂LPS）可能作为有效的免疫佐剂应用于HPV多肽-DCs疫苗研究,以有效控制或清除HPV感染细胞,还提示两种RNAi策略在体外培养细胞和动物模型中诱导的特异性6b/11型E7基因沉默可能通过抑制HPV病毒的复制而有利于控制疾病发展和传播,从免疫学治疗策略及基因治疗策略两个方面为低危型HPV感染相关性疾病尤其是CA的防治研究提供了一定的实验依据。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写、符号、术语清单及中英文对照
• 目录
• 第一部分
• 1.引言
• 2.材料
• 2.1 主要材料和试剂
• 2.2主要仪器设备
• 3.方法
• 3.1 MdDCs的诱导分化及刺激实验
• 3.2 TLR激动剂诱导的mdDCs表型及细胞因子分泌的检测
• 3.3 TLR激动剂刺激的E7-mdDCs对T淋巴细胞活化的检测
• 3.4 TLR激动剂刺激的E7-mdDCs诱导特异性CTL活性的检测
• 3.5 统计分析
• 4.结果
• 4.1 TLR激动剂对mdDCs功能分化、成熟及细胞因子分泌的影响
• 4.2 TLR激动剂刺激的E7-mdDCs对T淋巴细胞活化水平的影响
• 4.3 TLR激动剂对E7-mdDCs诱导的特异性CTL活性的影响
• 5.讨论
• 6.结论
• 参考文献
• 第二部分
• 1.引言
• 2.材料
• 2.1 主要材料和试剂
• 2.2 主要仪器设备
• 3.方法
• 3.1 表达HPV6bE7基因或HPV11E7基因细胞株的构建
• 3.2 siRNA二聚体及shRNA质粒表达载体的设计及合成（构建）
• 3.3 RNAi干预技术对靶基因沉默作用的体外实验
• 3.4 RNAi干预技术对靶基因沉默作用的动物实验
• 4.结果
• 4.1 表达目的基因HPV6bE7或HPV11E7的细胞株的鉴定
• 4.2 shRNA质粒表达载体的鉴定
• 4.3 RNAi对体外培养细胞靶基因mRNA表达的抑制作用
• 4.4 RNAi对小鼠移植肿瘤模型中靶基因mRNA表达的抑制作用
• 5.讨论
• 6.结论
• 参考文献
• 综述 生物体内SIRNA导入方法的进展
• 作者简历