棉花RNA依赖的RNA聚合酶（GhRdRP）基因的分离及功能分析

论文摘要

植物中RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）早在上世纪七十年代首次在中国大白菜中发现,随后又陆续在花椰菜、烟草、番茄、豇豆、黄瓜、水稻、大麦、玉米等植物中发现。RdRP以细胞或病毒RNA为模板合成短的cRNA,参与序列特异性的dsRNA诱导的RNA沉默及抗病毒防御途径,目前已成为国内外研究的热点。本文以经济作物棉花（Gossypium hirsutum）为实验材料,首次从棉花中克隆得到RdRP基因（GhRdRP）,并对其进行了序列比对,表达特性分析及初步功能鉴定,为进一步研究该基因的功能及作用机理奠定了基础。主要研究结果如下:1、利用同源序列设计兼并引物,通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从棉花中克隆得到一个RdRP基因,命名为GhRdRP。GenBank注册号为DQ445607,其全长3672 bp,编码一个1110氨基酸的蛋白质。序列分析发现,GhRdRP具有RdRP的功能保守区,该保守区内存在典型保守基序DbDGD（b代表任一残基）,是二价阳离子结合并产生催化活性的位点。GhRdRP同来源于拟南芥、烟草、番茄、大麦中的几种RdRP具有较高同源性,同源性高达59.29-66.37%;同酵母、粗糙脉胞菌及线虫中的RdRP也具有一定的同源性。cDNA序列与基因组序列比对后发现GhRdRP基因组序列内存在四个内含子,其中一个内含子位于5′UTR内。Southern杂交结果表明GhRdRP在棉花基因组中是以单拷贝的形式存在的。2、通过反向PCR方法我们获得了954 bp的目的基因启动子序列,经软件分析发现:该区域中存在SA、ABA、MeJA、生长素等响应元件,ACE、Box4、BoxI、G-box、I-Box等一些光诱导有关的元件,还有两个HSE热响应元件。半定量RT-PCR发现,GhRdRP转录水平受SA（salicylic acid）和5-ssal（5-Sulfo-salicylic acid）的诱导而提高;棉花幼苗接种棉花立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kuhn）后,GhRdRP表达量也有明显提高,可以推测GhRdRP参与了病原侵染反应过程。3、将GhRdRP构建了正义植物表达载体pBI121-GhRdRP,采用农杆菌介导的方法,转化烟草（NC89）,同时转空载体为对照。经卡那霉素筛选获得若干再生植株。经过PCR鉴定及半定量RT-PCR分析,结果证明GhRdRP在转基因烟草中得到成功表达。4、选取两个T0代转基因株系的自交种子扩繁,得到T1代转基因植株。在分子鉴定基础上,初步证明所测试的正义转基因株系在T1代中的遗传基本符合3:1的分离规律。抗病毒实验中,分别接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）7天后结果显示,转基因植株对TMV的抗病能力明显高于对照植株,而对CMV、PVY没有表现出明显的抗病性。5、从GhRdRP中选取C端222氨基酸片段构建原核表达载体pET-GhRdRP-222,并在大肠杆菌BL21 （DE3）中表达融合蛋白,将强诱导带切下,溶于PBS中获得抗原,并免疫小鼠制备抗体,其抗血清效价为1:1000。

论文目录

• 英文缩写符号及其中英文对照表
• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 RdRP 的分类
• 1.2 RNA 病毒RdRP 的结构及功能特点
• 1.3 植物中的 RdRP
• 1.3.1 植物中 RdRP 的存在
• 1.3.2 植物中 RdRP 的结构特点
• 1.3.3 植物中 RdRP 的功能
• 1.3.3.1 RdRP 与RNA 沉默
• 1.3.3.2 RdRP 与植物抗病毒防御
• 1.4 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 植物材料培养与处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶与各种生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物总RNA 的提取及检测
• 2.2.1.1 利用RNeasy Plant Mini Kit 提取总RNA
• 2.2.1.2 利用TRIZOL试剂盒提取RNA
• 2.2.1.3 甲醛变性凝胶进行RNA电泳
• 2.2.2 cDNA 第一链的合成
• 2.2.3 cDNA 回收纯化
• 2.2.4 cDNA 的5′加尾反应
• 2.2.5 cDNA 全长序列的获得
• 2.2.5.1 兼并引物 PCR 获得 GhRdRP 中间片段
• 2.2.5.2 5′RACE 获得5′端序列
• 2.2.5.3 3′RACE 获得3′端序列
• 2.2.5.4 cDNA 全长序列的获得
• 2.2.6 GhRdRP 全长基因组序列的获得
• 2.2.6.1 CTAB 法提取棉花基因组总 DNA
• 2.2.6.2 总DNA提取产物的纯化
• 2.2.7 GhRdRP基因启动子的克隆
• 2.2.7.1 GhRdRP基因启动子的反向PCR扩增
• 2.2.7.2 上游启动子序列的分析
• 2.2.8 电泳目的片段的回收
• 2.2.9 DNA 片段与克隆载体的连接
• 2.2.10 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2.2.11 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.12 质粒 DNA 的提取
• 2.2.12.1 碱法小量提取质粒 DNA
• 2.2.12.2 大量提取质粒 DNA
• 2.2.12.3 试剂盒质粒微量提取方案
• 2.2.13 对重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.14 半定量 RT-PCR 分析
• 2.2.14.1 总RNA 的提取
• 2.2.14.2 琼脂糖甲醛变性胶电泳
• 2.2.14.3 反转录cDNA第一条链的合成
• 2.2.14.4 半定量 RT-PCR 检测
• 2.2.15 Southern 杂交
• 2.2.15.1 基因组DNA 的提取
• 2.2.15.2 限制性内切酶消化
• 2.2.15.3 转膜及烘膜
• 2.2.15.4 探针合成
• 2.2.15.5 预杂交及杂交
• 2.2.16 植物表达载体的构建与转化
• 2.2.16.1 植物正义表达载体的构建
• 2.2.16.2 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.16.3 冻融法转化农杆菌
• 2.2.16.4 农杆菌介导转化烟草
• 2.2.17 原核表达及抗体制备
• 2.2.17.1 实验试剂配制
• 2.2.17.2 原核表达载体的构建
• 2.2.17.3 E.coli BL21 原核表达的诱导
• 2.2.17.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.17.5 抗体的制备
• 2.2.17.6 抗血清效价的测定（试管微量沉淀法）
• 3 结果与分析
• 3.1 棉花RNA 依赖的RNA 聚合酶基因的分离
• 3.1.1 棉花RNA 的提取及反转录
• 3.1.2 GhRdRP 中间片段的分离
• 3.1.3 GhRdRP 5′片段的分离
• 3.1.4 GhRdRP 3′片段的分离
• 3.1.5 GhRdRP 全长cDNA 的分离
• 3.2 GhRdRP 的序列分析
• 3.2.1 GhRdRP 的全长cDNA 分析
• 3.2.2 GhRdRP 编码的蛋白序列分析
• 3.2.3 GhRdRP 基因组及启动子序列分析
• 3.3 GhRdRP 在棉花基因组中的拷贝数分析
• 3.4 GhRdRP 的表达特性分析
• 3.5 GhRdRP 基因的原核诱导表达及抗体制备
• 3.6 GhRdRP基因在转基因烟草中的表达及初步抗病分析
• 3.6.1 转基因烟草表达载体的构建
• 3.6.2 转基因再生植株的获得
• 0 代转基因植株的鉴定'>3.6.3 T₀代转基因植株的鉴定
• 3.6.3.1 转基因植株的 PCR 鉴定
• 3.6.3.2 转基因植株的半定量RT-PCR分析
• 1代转基因植株的鉴定及转基因植株的抗性分析'>3.6.4 T₁代转基因植株的鉴定及转基因植株的抗性分析
• 1代转基因植株的PCR鉴定'>3.6.4.1 T₁代转基因植株的PCR鉴定
• 3.6.4.2 病毒抗性分析
• 3.6.4.3 下一步实验计划
• 4 讨论
• 4.1 GhRdRP 的蛋白结构特征
• 4.2 GhRdRP 的诱导表达及与相应启动子序列的关系
• 4.3 GhRdRP 对转基因烟草抗病性的作用
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士阶段已发表论文