论文摘要
目的：自超极化激活内向电流被发现以来,其特性就被广为研究。但因其作用表现和表达分布的复杂多样性,其在心脏起搏活动中的确切作用一直存在争议。本研究拟从电生理学方面明确超极化激活内向离子通道在早期胚胎心肌细胞上所起的作用。方法与结果：1.观察If阻断剂对If，ICaL和ICaT电流的影响方法：采用胶原酶B消化获得单个小鼠胚胎心肌细胞并培养24-36小时。选择跳动的单个细胞,细胞为E10.5天心肌细胞,1 mMCs+离子作为阻断剂,以全细胞电压钳模式记录心肌细胞的If,IcaL和ICaT电流表达。结果：lmM Cs+显著抑制If（减少93.1-1.7%,n=13,p<0.05）,冲洗后能完全恢复。与此同时,Cs+仅轻度升高L型钙电流（至15.5士4.12%,n--11,p<0.05）。对T型钙电流基本无影响（n=11,p>0.05）。这表明相对L型钙电流和T型钙电流而言,Cs+对If通道存在相对特异阻断性。因此我们在后续实验中采用Cs+作为If通道阻断剂来观察各项目。2.If在E9.5-E10.5起搏样细胞（P-Iike）起搏活动中所起的作用方法：采用胶原酶B消化分离以获得单个小鼠胚胎心肌细胞,培养24-36小时后,选择E9.5和E10.5起搏样细胞（P-like）进行研究,应用全细胞电流钳模式以记录E9.5和E10.5起搏样细胞的动作电位,观察比较If在E9.5-E10.5起搏样细胞（P-like）起搏活动中所起的作用。结果：Cs+在E9.5-E10.5起搏样细胞上引起负性调节效果。此效果在全部的E9.5（n=3）和E10.5（n=3）上均可发现。在E9.5,Cs+使得动作电位频率降低18.7土2.2%（n=3,p>0.05）,4期自动除极速率降低21.34-3.1%（n=3）。在E10.5, 1mM Cs+存在和E9.5类似的作用效果,但未发现统计学意义。动作电位频率降低24.6±-2.3%,（p<0.05）,4期自动除极速率降低23.9±-3.5%,p>0.05。3.If在E9.5-E10.5心室样细胞（V-like）起搏活动中所起的作用方法：采用胶原酶B消化分离以获得单个小鼠胚胎心肌细胞,培养24-36小时后,选择E9.5和E10.5心室样细胞（V-like）进行研究,应用全细胞电流钳模式以记录E9.5和E10.5心室样细胞的动作电位,观察比较If在E9.5-E10.5心室样细胞（V-like）起搏活动中所起的作用。结果：在81.8%（11个细胞中的9个）E9.5的V-like细胞和27.3%（22个细胞中的6个）的E10.5的V-like细胞上观察到了Cs+的影响。在E9.5的V-like细胞上,Cs+降低动作电位频率70.5±6.9%（n=9,p<0.01）,同时降低4期自动除极速率75.6±4.8%（n=6,p<0.05）。在E10.5,Cs+的作用效果要弱于E9.5。Cs+降低动作电位频率65.4±7.2%（p<0.05）,同时降低4期自动除极速率75.1±5.9%（p<0.05）。在E17.5也观察到Cs+存在相似的作用效果。4.If和动作电位的联系方法：采用胶原酶B消化分离以获得单个小鼠胚胎心肌细胞,培养24-36小时后,选择E8.5和E10.5的成功记录到动作电位的,心房样细胞atrial-like （A-like） cells和心室样细胞及起搏样细胞进行研究。观察这些细胞上是否存在If电流的表达。结果：E10.5心脏上,HCN4是mRNA水平的主要表达亚型,但Cs+对动作电位的影响仅在一部分细胞上能看到,这可能是由于If的功能表达与mRNA水平并不一致。因此我们观察了存在动作电位的细胞上If电流的表达。在E8.5,If能在91.7%的起搏样细胞,90%的心房样细胞和80%的心室样细胞上检测到。而在E10.5,If存在于70%的起搏样细胞,但只有50%的心房样细胞或心室样细胞上检测到If。以上结果表明,在E10.5的心室肌细胞上,动作电位的产生和If并无直接联系。结论：1.在胚胎发育过程中,超极化激活内向电流能稳定持续参与心脏起搏样细胞的起搏活动。2.在胚胎发育过程中,胚胎心室起搏活动与超极化激活内向电流之间并无必然联系。目的：为明确超极化激活内向离子通道作用表现和表达分布的复杂多样性与其亚型表达之间的关系,本研究拟从分子生物学方面明确超极化激活内向离子通道的亚型与其在早期胚胎心肌细胞上所起的作用之间的关系。方法与结果：1.HCN亚型表达的发育性变化方法：采用RT-PCR技术,比较在早期胚胎发育过程中,从E8.5至E10.5,小鼠胚胎心室肌组织HCN2和HCN4亚型在mRNA水平的表达。结果：早期胚胎发育期中,Cs+对心室细胞起搏活动影响的变化可能归根于基因表达的差异,因此我们检测了HCN2和HCN4亚型在mRNA水平的表达。在胚胎发育过程中,HCN4表达下调而HCN2表达上调。从E8.5至E10.5,HCN4均为心脏的HCN主要表达亚型。虽然HCN2和HCN4改变量并不显著（p>0.05）,但己表现出逐步变化的趋势。2.敲除HCN4对E10.5的心室肌细胞的动作电位和4期自动除极速率的影响方法：采用小干扰核糖核酸技术（siRNA）以观察敲除HCN4基因后对E10.5心室样细胞的影响。结果：为了观察HCN4-型在E10.5心室肌细胞上的具体功能,我们应用小干扰核糖核酸技术（SiRNA）来敲除HCN4亚型。在敲除组,仅有20%的心室肌细胞检测到If电流,而且If的电流密度从26.0±2.7pA/pF（对照组,n=8）降低至5.6±1.8pA/pF（n=10）（p<0.01,对照组：敲除组）。然而,心室肌细胞的动作电位和4期自动除极速率均未改变（p>0.05）。以上结果表明,尽管HCN4在E10.5的心室肌细胞的mRNA水平显著表达,但HCN4所编码的If在胚胎心室肌细胞的起搏活动中所起作用有限。结论：1.HCN4确实是早期胚胎心脏上超极化激活阳离子通道的主要表型。2.超极化激活内向电流的作用除了mRNA表达水平影响以外,可能更重要受到具体亚型功能表达的影响。3.胚胎心室起搏活动不依赖于HCN4编码的If。
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