猪繁殖与呼吸综合征病毒分子遗传变异与疫苗研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）俗称“猪蓝耳病”,是目前危害世界养猪业最严重的传染病之一,在临床上以造成怀孕母猪早产、流产、死胎以及仔猪的呼吸系统症状为主要特征。本文从PRRS的血清学调查、分子遗传变异、灭活疫苗研制、混合感染和PRRSV传染性cDNA克隆等方面进行了研究和探讨。1、PRRS血清学调查与病毒分离鉴定为了调查山东地区PRRS的感染状况,2004年至2006年从山东各地未免疫PRRS疫苗的猪场采集1,332份血样,采用IDEXX公司的间接ELISA试剂盒进行检测。结果表明,59.5%的血清样品呈PRRS抗体阳性,其中偏远农村的散养猪场和小规模猪场只有32.5%的血清样品呈PRRS阳性,然而,从大型规模化猪场采集的血清样品中PRRS抗体的阳性比例占83.1%。从PRRS阳性的猪场样品中分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,在Marc-145细胞上呈现典型的细胞病变（CPE）,但不同PRRSV分离株产生CPE的时间与类型不尽相同,并且不同分离株的毒力也存在较大差异。本研究结果表明,PRRS的流行状况与猪场规模大小和猪群密度密切相关,并且本地区猪场中存在不同表型的PRRSV分离株。2、PRRSV山东分离株分子遗传变异研究设计了4对PRRSV特异性引物,分别扩增5个PRRSV山东分离株的ORF5基因、ORF6基因、ORF7基因和Nsp2基因,并克隆至pMD18-T载体,送至公司测序,采用分子生物学软件分析病毒的分子遗传变异规律。序列分析表明,5个分离株ORF5基因的核苷酸序列同源性为88.2%-99.2%, ORF6基因的同源性为94.9%-99.8%, ORF7基因的同源性为93.5%-100%。其中两株PRRSV传统毒株与北美型代表株VR2332的核苷酸序列高度同源,而3株PRRSV变异株Nsp2蛋白缺失30个氨基酸,与国内以前报道的变异株JXA1株高度同源,与VR-2332株同源性相差较大。研究结果表明,山东省猪场近几年同时存在PRRSV传统毒株和变异株感染,并且近年来,山东PRRSV流行毒株有从传统美洲型向Nsp2基因缺失变异株演化的趋势。3、PRRS灭活疫苗（SD1株）研究在对PRRSV SD1株细胞生物学培养特性研究的基础上,我们对PRRS灭活疫苗生产工艺进行了研究,包括毒种繁殖、灭活方法、乳化工艺、安全检验与效力检验等内容。将效价大于107.0TCID50/mL的PRRSV-SD1株病毒培养液用终浓度为0.1%的甲醛于37℃灭活20 h,加入4%吐温-80作为水相,与油相（按油水比2:1的比例）于胶体磨中乳化而成。疫苗性状为油包水型,无菌检验合格,无毒副作用及其他不良反应。效力试验结果显示,当血清中和抗体效价≥1:10时,猪攻毒后表现基本正常,无不良反应。疫苗的免疫有效期可达6个月,4℃保存期暂定为12个月。田间试验和区域试验表明,母猪免疫后弱仔率、木乃伊胎率、死胎率下降约8%,仔猪成活率升高约10%,免疫猪群的中和抗体阳性率（≥1:10）可达80%以上。4、从PRRS疑似病料中检测PCV2的研究2005年至2007年期间从山东各地共收集156份PRRS疑似病料（组织和血清）,其中102份经RT-PCR确定为PRRSV阳性。设计特异性引物,采用PCR技术,从PRRS疑似病料中检测猪圆环病毒2型（PCV2）。结果显示,有46份（29.5%）组织病料匀浆（肺、肝、脾、肾和淋巴结）为PCV2型阳性,然而,只有32份血清（20.5%）为PCV2阳性。其中,PRRS阳性病料中PCV2的阳性率为33.3%（34/102）,而PRRS阴性病料中PCV2的阳性率仅为22.2%（12/54）。根据PCV2开放阅读框2（ORF2）绘制的遗传进化树分析表明,本研究中分离的PCV2核苷酸序列同源性在98.3%-100%之间,与国内外其他分离株相比,本地分离株更接近于法国分离株。研究结果表明,本地区PRRS疑似病料中PCV2的阳性率较高,而且其感染率在PRRS阳性病料和阴性病料中有着明显差异（P<0.05）。5、应用PRRSV传染性cDNA克隆构建PRRSV-PCV2重组病毒的研究PRRSV传染性cDNA克隆的研制成功使我们能够运用反向遗传学技术对病毒的基因组进行操作,在体外转染细胞,产生带有新的遗传标记的PRRSV。在本研究中,我们对运用PRRSV传染性cDNA克隆表达外源基因进行了探讨和尝试。因为PCV2是猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）的主要致病因子之一,而核衣壳蛋白基因（Capsid protein gene,即ORF2 gene）是PCV2的主要结构基因,其编码的核衣壳蛋白起具有重要免疫原性。在本研究中,我们首先采用PCR扩增出PCV2 ORF2基因,然后通过克隆技术插入PRRSV传染性cDNA分子克隆,转染细胞产生PRRSV-PCV2重组病毒。运用PCR技术和免疫荧光技术在重组病毒感染的细胞中成功验证了PCV2核衣壳蛋白的表达。为了进一步评估PRRSV-PCV2重组病毒的免疫原性,分别用PRRSV原始野毒和PRRSV-PCV2重组病毒各接种5头仔猪,另外一组接种Marc-145细胞培养液作为对照组。试验仔猪于第0d和第21d接种两次,颈部肌肉注射,然后分别于接种后4、7、14、21、28和35d各采血一次,检测PRRSV病毒血症持续时间和PRRSV、PCV2抗体水平。结果显示,PCV2抗体在接种后21d开始转阳,至少维持到接种后35d。与PRRSV原始野毒相比,PRRSV-PCV2重组病毒引起的病毒血症明显缩短。试验结果表明,PRRSV能够作为载体表达插入的外源基因,PRRSV重组病毒有望在不远的将来发展成为猪用多价疫苗,在临床上起到“一针防多病”的免疫功效。

论文目录

• 英文缩写注释
• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 综述一 猪繁殖与呼吸综合征研究进展
• 1. 病原学
• 1.1 PRRSV 的分类地位及生物学特性
• 1.2 病毒基因组结构
• 1.3 病毒基因组的转录及表达
• 1.4 病毒基因组编码的主要蛋白
• 2. 流行病学
• 3. 临床症状
• 4. 病理变化
• 4.1 临床病理学
• 4.2 肉眼病变
• 4.3 显微病变
• 4.4 超微结构病变
• 5. 持续性感染
• 6. 病毒遗传变异
• 6.1 生物性与抗原性变异
• 6.2 致病性与病变差异
• 6.3 基因型与遗传变异
• 7. 实验室诊断技术
• 7.1 抗原学检测技术
• 7.1.1 病毒分离技术
• 7.1.2 免疫过氧化物酶技术（IPA）
• 7.1.3 免疫胶体金技术（IGSS）
• 7.1.4 免疫荧光抗体染色技术
• 7.1.5 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验
• 7.2 血清学诊断技术
• 7.2.1 免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）
• 7.2.2 间接荧光抗体试验（IFA）
• 7.2.3 血清中和试验（SN）
• 7.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 7.3 分子生物学诊断技术
• 7.3.1 核酸探针技术
• 7.3.2 RT-PCR 技术
• 8. 免疫应答
• 8.1 体液免疫
• 8.2 细胞免疫
• 9. 防治对策
• 10. 结语
• 综述二 猪繁殖与呼吸综合征病毒传染性 cDNA 分子克隆研究进展
• 1. 正链 RNA 病毒传染性cDNA 分子克隆的基本原理和构建方法
• 2. PRRSV 基因组和亚基因mRNA 的特征
• 3. PRRSV 传染性cDNA 分子克隆的构建
• 4. PRRSV 传染性cDNA 分子克隆的应用
• 4.1 定点突变
• 4.2 基因缺失
• 4.3 表达外源序列
• 4.4 构建多病毒嵌合体
• 4.5 动物接种试验
• 5. 前景展望
• 综述三 猪断奶后多系统衰竭综合征诊断技术进展
• 1. 流行病学
• 2. 临床症状
• 3. 病理变化
• 4. 病毒分离
• 5. 聚合酶链式反应（PCR）
• 6. 限制性片段长度多态性分析（RFLP）
• 7. 免疫组织化学技术（IHC）
• 8. 原位核酸杂交（ISH）
• 9. 免疫荧光技术
• 10. 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 试验研究
• 第一部分 PRRS 血清学调查与病毒分离鉴定
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 主要试剂和材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 样品采集
• 2.2.2 ELISA
• 2.2.3 病毒分离
• 2.2.4 PRRSV 分离株毒价测定
• 2.2.5 免疫荧光抗体试验
• 2.2.6 动物回归试验
• 3. 结果
• 3.1 ELISA 检测结果
• 3.2 病毒分离结果
• 3.3 PRRSV 分离株毒价测定
• 3.4 免疫荧光抗体试验
• 3.5 动物回归试验结果
• 3.5.1 临床症状与病理剖检变化
• 3.5.2 肺脏病理组织学变化
• 3.5.3 病毒血症持续时间研究
• 4.讨论
• 第二部分 PRRSV 山东分离株分子遗传变异分析
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 主要试剂和材料
• 2.1.1 病毒来源
• 2.1.2 细胞、质粒和菌体
• 2.1.3 试剂与酶类
• 2.1.4 仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 样品准备与处理
• 2.2.2 RT-PCR
• 3. 结果
• 3.1 PRRSV 分离株的基因扩增结果
• 3.2 核苷酸和氨基酸序列分析
• 3.2.1 ORF5 基因核苷酸及推导的氨基酸序列分析
• 3.2.2 ORF6 基因核苷酸序列分析
• 3.2.3 ORF7 基因核苷酸序列分析
• 3.2.4 部分 Nsp2 基因推导氨基酸序列分析
• 4.讨论
• 第三部分 PRRS 油乳剂灭活疫苗研究
• 试验一 PRRSV SD1 株细胞培养生物学特性研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要试剂与材料
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 试验二 PRRS 灭活疫苗（SD1 株）的研制与安全性试验
• 1. 材料与方法
• 1.1 毒种
• 1.2 制苗用毒液的繁殖
• 1.3 灭活
• 1.4 制苗
• 1.5 成品检验
• 2. 疫苗试制及检验结果
• 50测定'>2.1 TCID₅₀测定
• 2.2 灭活检验
• 2.3 疫苗性状测定
• 2.4 无菌检验
• 2.5 甲醛、硫柳汞含量测定
• 2.6 安全检验
• 试验三 PRRS 灭活疫苗（SD1 株）效力试验研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 2.1 仔猪免疫效力试验与攻毒保护试验
• 2.2 母猪免疫效力试验与攻毒保护试验
• 3. 讨论
• 试验四 PRRS 灭活疫苗（SD1 株）免疫期与保存期试验
• 1. 材料与方法
• 1.1 Marc-145 细胞
• 1.2 MEM
• 1.3 小牛血清
• 1.4 疫苗
• 1.5 试验动物
• 1.6 试验方法
• 2. 结果
• 2.1 免疫期试验
• 2.2 保存期试验
• 试验五 PRRS 灭活疫苗（SD1 株）田间试验
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 试验六 PRRS 灭活疫苗区域试验报告
• 1. 材料
• 2. 结果
• 第四部分 从 PRRS 疑似病料中检测 PCV2 的研究
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 主要试剂材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 病料收集
• 2.2.2 PCR 检测圆环病毒2 型
• 2.2.3 病毒电镜技术
• 2.2.4 病毒遗传进化树分析
• 3. 结果
• 3.1 PCR 检测结果
• 3.2 病毒电镜观察
• 3.3 病毒同源性比较和遗传进化树分析
• 4. 讨论
• 第五部分 应用 PRRSV 传染性克隆构建 PRRSV-PCV2 重组病毒的研究
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 主要试剂与材料
• 2.2 试验方法
• 3. 结果
• 3.1 PCR 扩增 PCV2 ORF2 研究
• 3.2 PRRSV-PCV2 重组cDNA 克隆的 PCR 鉴定
• 3.3 限制性酶切鉴定 PRRSV-PCV2 重组cDNA 克隆
• 3.4 PRRSV-PCV2 序列分析
• 3.5 Marc-145 细胞转染试验
• 3.6 免疫荧光染色试验
• 3.7 病毒噬斑形成单位（PFU）试验
• 3.8 动物接种试验
• 4. 讨论
• 试验结论与创新点
• 参考文献
• 附录: 读博士学位期间发表论文情况
• 致谢