论文摘要
急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是指由心源性以外的各种肺内外致病因素所导致的急性、进行性、缺氧性呼吸衰竭,主要表现为顽固性呼吸困难、低氧血症、肺顺应性降低等。细菌感染所致的脓毒血症是引起ALI的主要原因,革兰氏阴性菌（gramnegative bacterium,G-）细胞壁的主要成分脂多糖（1ipopolysaccharide,LPS）是主要的致病因素,利用LPS复制ALI的动物模型进行研究是科研工作中的常用手段之一。内源性硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）主要由半胱氨酸等含硫氨基酸在胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase,CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase,CSE）作用下生成,它对神经系统特别是海马的功能具有调节作用,并可以调节消化道和血管平滑肌的张力。随着对H2S研究的逐渐深入,越来越多的证据证实它参与多种呼吸系统疾病的发生发展过程,是继一氧化氮（nitric oxide,NO）和一氧化碳（carbon monoxide,CO）之后的一种新型气体信使分子。本实验首先观察了在内毒素性ALI病程中H2S和CSE的时程性变化,在此基础上分别给予H2S供体氢硫化钠（sodium hydrosulfide,NaHS）和CSE抑制剂炔丙基甘氨酸（DL-propargylglycine,PPG）,观察它们对肺组织氧化应激、炎症细胞、炎症介质、细胞凋亡和肺表面活性物质（pulmoalverolar surfactant,PS）等方面的影响,从细胞、基因、蛋白水平多层次、多方面探讨H2S在肺损伤中的作用及机制,为临床治疗肺损伤提供理论依据。第一部分LPS致大鼠急性肺损伤硫化氢/胱硫醚-γ-裂解酶体系的变化目的:观察大鼠内毒素性ALI过程中白介素-1β（IL-1β）、白介素-10（IL-10）和H2S/CSE体系的时程性变化及关系,探讨LPS诱导ALI的发病机制。方法:健康雄性SD大鼠（270±20g）共80只,随机分为6组,Ⅰ空白对照组;ⅡLPS 1 h组;ⅢLPS 3 h组;ⅣLPS 6 h组;ⅤLPS 9 h组;ⅥLPS 12 h组,空白对照组共40只（不同时间点各8只）。用20%的乌拉坦（5 ml/kg）麻醉大鼠,LPS 1 h、3 h、6 h、9 h和12 h组舌静脉注射LPS（5 mg/kg）。分别于给药1 h、3 h、6 h、9 h及12 h后采集样品;检测肺系数和肺湿/干重比的变化;去蛋白法检测血浆中H2S含量、亚甲基蓝法检测肺组织CSE活性、酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中IL-1β和IL-10的变化;光镜、电镜观察肺组织病理变化。结果:1.空白对照组大鼠肺系数和肺湿/干重比在1 h 12 h之间无明显变化。给予LPS 1 h后大鼠肺系数和肺湿/干重比与空白对照组比较无显著差异（0.47±0.02 VS 0.46±0.03,4.65±0.34 VS 4.41±0.33,P > 0.05）,给予LPS 3 h后肺系数和肺湿/干重比开始明显升高（0.52±0.03 VS 0.47±0.03,5.24±0.45 VS 4.43±0.21,P < 0.05）,给予LPS 6 h、9 h和12 h后肺系数和肺湿/干重比均比空白对照组升高且维持在较高水平（P < 0.05或P < 0.01）。2.空白对照组大鼠血清中IL-1β和IL-10浓度在1 h 12 h之间无明显变化。给予LPS 1 h后大鼠血清中IL-1β浓度较空白对照组显著升高（11.18±0.59 VS 9.26±1.37,P < 0.05）并达高峰,给予LPS 3 h、6 h、9 h及12 h后血清中IL-1β浓度较LPS 1 h随时程延长逐渐下降,但与空白对照组比较均明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。给予LPS 1 h后大鼠血清中IL-10浓度较空白对照组显著升高（213.46±12.84 VS 11.84±1.25,P < 0.01）,给予LPS 3 h时达高峰（230.46±9.49 VS 10.73±9.97,P < 0.01）,6 h、9 h及12 h后血清中IL-10浓度较LPS 1 h和3 h时降低,并随时程延长逐渐下降,但与空白对照组比较均明显升高（P < 0.01）。3.空白对照组大鼠血浆中H2S含量和肺组织CSE活性在1 h 12 h之间无明显变化。给予LPS 1 h后大鼠血浆中H2S含量和肺组织CSE活性较空白对照组无显著差异（35.10±3.81 VS 37.22±4.48,4.61±0.75 VS 4.68±0.63,P > 0.05）,给予LPS 3 h后血浆中H2S含量和肺组织CSE活性明显降低（24.90±2.21 VS 36.67±5.35,3.35±0.98 VS 4.61±0.68,P < 0.01）,给予LPS 6 h、9 h和12 h后血浆中H2S含量和肺组织CSE活性与空白对照组比较均明显降低（P < 0.01）。4.高倍光镜下显示,空白对照组肺泡结构完整,给予LPS 1 h后无明显变化,给予LPS 3 h、6 h、9 h及12 h后肺组织明显受损,可见肺泡间隔增宽,肺泡完整性被破坏,腔内有大量渗出,炎性细胞浸润。电镜下显示,空白对照组肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构基本正常,给予LPS 1 h后无明显变化,给予LPS 3 h、6 h、9 h及12 h后肺组织超微结构明显受损,粗面内质网脱颗粒,线粒体水肿、嵴减少嗜锇性板层小体的板层结构显著融合或消失。结论:大鼠静脉注射LPS后,1 h时肺组织未出现明显损伤,但炎性细胞因子显著升高。给予LPS 3 h至12 h时均存在肺损伤,IL-1β和IL-10均明显升高,内源性H2S和CSE均明显降低。IL-1β、IL-10和H2S/ CSE体系可能参与内毒素性ALI的病理生理过程。第二部分硫化氢对大鼠内毒素性急性肺损伤组织氧化应激的影响目的:观察H2S对大鼠内毒素性ALI组织过氧化物和抗氧化物酶的影响,并探讨其作用机制。方法:健康成年雄性SD大鼠（270±20g）共48只,随机分为6组,每组8只,分别为Ⅰ空白对照组;ⅡLPS组;ⅢLPS+NaHS低剂量组;ⅣLPS+NaHS中剂量组;ⅤLPS+NaHS高剂量组;ⅥLPS+PPG组。用20%的乌拉坦（5 ml/kg）麻醉大鼠,LPS组舌静脉注射LPS,LPS+NaHS低、中、高剂量组分别于舌静脉注射LPS 3 h时腹腔注射0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg的NaHS,LPS+PPG组于舌静脉注射LPS 3 h时腹腔注射30 mg/kg的PPG,空白对照组舌静脉注射等容量的生理盐水。各组大鼠均于给予LPS或生理盐水6 h时处死。分别测定各组大鼠肺系数和肺湿/干重比的变化;去蛋白法测定血浆中H2S含量、亚甲基蓝法测定肺组织CSE活性、硫代巴比妥酸法测定肺组织丙二醛（MDA）含量、黄嘌呤氧化酶法测定肺组织超氧化物歧化酶（SOD）活性和酶促反应谷胱甘肽消耗法测定肺组织谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）活性;光镜、电镜观察肺组织病理变化。结果:1.与空白对照组比较,LPS组大鼠肺系数和肺湿/干重比明显升高（P < 0.01）。与LPS组比较,LPS+NaHS低、中、高剂量组大鼠肺系数和肺湿/干重比均明显降低（P < 0.05或P < 0.01）,而LPS+PPG组上述两指标均明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。2.与空白对照组比较,LPS组大鼠血浆中H2S含量和肺组织中CSE活性明显降低（P < 0.01）。与LPS组比较,LPS+NaHS低、中、高剂量组血浆中H2S含量和肺组织中CSE活性均显著升高（P < 0.05或P < 0.01）,而LPS+PPG组上述两项指标均明显降低（P < 0.05）。3.与空白对照组比较,LPS组肺组织MDA含量明显升高（4.04±1.21 VS 8.86±1.36,P < 0.01）、SOD和GSH-PX活性均明显降低（28.35±1.94 VS 16.38±4.42,21.45±2.99 VS 11.45±2.39,P < 0.01）。与LPS组比较,LPS+NaHS低、中、高剂量组肺组织MDA含量降低、SOD和GSH-PX活性均显著升高（P < 0.05或P < 0.01）;LPS+PPG组肺组织MDA含量升高、SOD活性降低（P < 0.05或P < 0.01）,GSH-PX活性虽有所降低但无统计学意义。4.光镜下观察显示,空白对照组大鼠肺泡结构完整,LPS组肺组织明显受损,可见肺泡间隔增宽,肺泡完整性被破坏,腔内有大量渗出,炎性细胞浸润。LPS+NaHS低、中、高剂量组上述肺损伤程度较LPS组有所减轻;LPS+PPG组肺损伤程度加重。电镜下观察显示,空白对照组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构基本正常。LPS组肺组织超微结构明显受损,粗面内质网脱颗粒,线粒体水肿、嵴减少嗜锇性板层小体的板层结构显著融合或消失。LPS+NaHS低、中、高剂量组大鼠肺组织超微结构与LPS组比较肺损伤程度有所减轻,LPS+PPG组仍存在严重肺损伤。结论:ALI早期应用NaHS后,CSE活性增强,H2S生成增加,肺系数和肺湿/干重比降低,脂质过氧化物MDA生成减少,抗过氧化物酶SOD和GSH-PX活性增强,肺损伤减轻。而应用PPG后,CSE活性降低,H2S生成减少,肺系数和肺湿/干重比升高,MDA生成增加,SOD活性降低,肺损伤加重。第三部分硫化氢对大鼠内毒素性急性肺损伤组织炎症细胞因子的影响目的:观察H2S对大鼠内毒素性ALI组织炎症细胞因子、核内转录因子和粘附分子的影响,并探讨其作用机制。方法:健康成年雄性SD大鼠（270±20g）共48只,随机分为6组,每组8只,分别为Ⅰ空白对照组;ⅡLPS组;ⅢLPS+NaHS低剂量组;ⅣLPS+NaHS中剂量组;ⅤLPS+NaHS高剂量组;ⅥLPS+PPG组。用20%的乌拉坦（5 ml/kg）麻醉大鼠,LPS组舌静脉注射LPS,LPS+NaHS低、中、高剂量组分别于舌静脉注射LPS 3 h时腹腔注射0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg的NaHS,LPS+PPG组于舌静脉注射LPS 3 h时腹腔注射30 mg/kg的PPG,空白对照组舌静脉注射等容量的生理盐水。各组大鼠均于给予LPS或生理盐水6 h时处死。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中IL-1β和IL-10含量;逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）测定肺组织中IL-1β、IL-10和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）mRNA基因表达;凝胶迁移电泳（EMSA）法测定核内转录因子-κBp65（NF-κBp65）的活性。结果:1.与空白对照组比较,LPS组大鼠血清中IL-1β和IL-10浓度明显升高（P < 0.01）。与LPS组比较,LPS+NaHS低、中、高剂量组血清中IL-1β浓度明显降低（13.96±0.71 VS 15.01±0.81,12.45±1.35 VS 15.01±0.81,12.24±0.90 VS 15.01±0.81,P < 0.05或P < 0.01）,LPS+NaHS中、高剂量组血清中IL-10浓度明显升高（137.68±6.27 VS 127.04±5.30,138.56±6.29 VS 127.04±5.30,P < 0.05）。与LPS组比较,LPS+PPG组血清中IL-1β浓度明显升高（21.58±3.29 VS 15.01±0.81,P < 0.05）,血清中IL-10浓度明显降低（113.28±9.68 VS 127.04±5.30,P < 0.05）。2.空白对照组大鼠肺组织可见到IL-1β、IL-10和ICAM-1 mRNA基因表达,及NF-κBp65蛋白表达。与空白对照组比较,LPS组肺组织中IL-1β、IL-10和ICAM-1 mRNA基因表达和NF-κBp65活性均明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。与LPS组比较,LPS+NaHS低、中、高剂量组肺组织中IL-1βmRNA基因表达和NF-κBp65活性均明显降低,LPS+NaHS中、高剂量组ICAM-1 mRNA基因表达明显降低、IL-10 mRNA基因表达明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。与LPS组比较,LPS+PPG组肺组织中IL-1β和ICAM-1 mRNA基因表达及NF-κBp65活性均明显升高,IL-10 mRNA基因表达明显降低（P < 0.05）。结论:ALI早期给予NaHS后,IL-1β和ICAM-1 mRNA基因表达及NF-κBp65活性减弱,IL-10 mRNA基因表达增强,肺损伤减轻;而给予PPG后,IL-1β和ICAM-1 mRNA基因表达及NF-κBp65活性增强,IL-10 mRNA基因表达减弱,肺损伤加重。第四部分硫化氢对大鼠内毒素性急性肺损伤组织细胞凋亡的影响目的:观察H2S对大鼠内毒素性ALI组织细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:健康成年雄性SD大鼠（270±20g）共48只,随机分为6组,每组8只,分别为Ⅰ空白对照组;ⅡLPS组;ⅢLPS+NaHS低剂量组;ⅣLPS+NaHS中剂量组;ⅤLPS+NaHS高剂量组;ⅥLPS+PPG组。用20%的乌拉坦（5 ml/kg）麻醉大鼠,LPS组舌静脉注射LPS,LPS + NaHS低、中、高剂量组分别于舌静脉注射LPS 3 h时腹腔注射0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg的NaHS,LPS+PPG组于舌静脉注射LPS3 h时腹腔注射30 mg/kg的PPG,空白对照组舌静脉注射等容量的生理盐水。各组大鼠均于给予LPS或生理盐水6 h时处死。采用流式细胞术（FCM）检测肺细胞凋亡;免疫组化法检测肺组织Bcl-2和Bax的表达;Western blotting法检测肺组织Caspase-3和Caspase-9的表达。结果:1. LPS组肺组织细胞凋亡率较空白对照组明显升高（P < 0.01）。与LPS组比较,LPS+NaHS中、高剂量组肺组织细胞凋亡率明显降低（P < 0.01）,LPS+PPG组肺组织细胞凋亡率明显升高（P < 0.05）。2.免疫组化结果显示,Bcl-2和Bax蛋白阳性染色呈棕黄色,主要在肺泡和支气管上皮细胞,血管内皮细胞和炎性细胞也有表达,空白对照组可见Bcl-2和Bax蛋白阳性细胞。与空白对照组比较,LPS组Bcl-2蛋白表达明显减弱,Bax蛋白表达明显增强,Bcl-2/Bax比值明显降低（P < 0.01）。与LPS组比较,LPS+NaHS高剂量组Bcl-2阳性细胞表达明显增强（P < 0.05）,LPS+NaHS中、高剂量组Bax阳性细胞表达明显减弱（P < 0.05）,LPS+NaHS低、中、高剂量组Bcl-2/Bax比值明显增加（P < 0.05或P < 0.01）。与LPS组比较,LPS+PPG组Bcl-2阳性细胞表达明显减弱（P < 0.05）,Bax阳性细胞表达明显增强（P < 0.05）,Bcl-2/Bax比值明显降低（P < 0.01）。3. Western blotting法检测结果显示,空白对照组仅有少量的Caspase-3和Caspase-9的表达,LPS组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达较空白对照组明显增强（P < 0.05或P < 0.01）。与LPS组比较,LPS+NaHS高剂量组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达明显减弱（P < 0.05）,LPS+PPG组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达明显增强（P < 0.05）。结论:ALI早期给予NaHS后,肺细胞凋亡率降低,Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达减弱,Bcl-2蛋白表达增强,肺损伤减轻;给予PPG后,肺细胞凋亡率升高,Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减弱,肺损伤加重。第五部分硫化氢对大鼠内毒素性急性肺损伤肺泡表面活性物质的影响目的:观察H2S对大鼠内毒素性ALI肺泡表面活性物质（PS）的影响,探讨其作用机制。方法:健康成年雄性SD大鼠（270±20 g）共48只,随机分为6组,每组8只,分别为Ⅰ空白对照组;ⅡLPS组;ⅢLPS+NaHS低剂量组;ⅣLPS+NaHS中剂量组;ⅤLPS+NaHS高剂量组;ⅥLPS+PPG组。用20%的乌拉坦（5 ml/kg）麻醉大鼠,LPS组舌静脉注射LPS,LPS+NaHS低、中、高剂量组分别于舌静脉注射LPS 3 h时腹腔注射0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg的NaHS,LPS+PPG组于舌静脉注射LPS 3 h时腹腔注射30 mg/kg的PPG,空白对照组舌静脉注射等容量的生理盐水。各组大鼠均于给予LPS或生理盐水6 h时处死。应用RT-PCR法测定肺组织中肺泡表面活性蛋白-A、B、C（SP-A、B、C）mRNA基因表达的变化;测定各组大鼠肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白（TP）和总磷脂（TPL）含量的变化。1.空白对照组大鼠肺组织可见到SP-A、SP-B和SP-C mRNA基因表达。与空白对照组比较,LPS组肺组织中SP-A、SP-B和SP-C mRNA基因表达均明显降低（0.93±0.05 VS 1.35±0.11,1.18±0.10 VS 1.12±0.10,0.72±0.05 VS 0.81±0.08, P < 0.05或P < 0.01）。与LPS组比较,LPS+NaHS中、高剂量组肺组织中SP-A和SP-B mRNA基因表达升高（P < 0.05或P < 0.01）,LPS+NaHS各剂量组SP-C mRNA基因表达无明显变化。与LPS组比较,LPS+PPG组SP-A、SP-B和SP-C mRNA基因表达均明显降低（ 0.85±0.08 VS 0.93±0.05 , 0.74±0.06 VS 0.82±0.08 , 0.66±0.05 VS 0.72±0.05,P < 0.05）。2.空白对照组大鼠BALF中均可检测到TP和TPL。与空白对照组比较,LPS组BALF中TP含量明显升高（0.39±0.33 VS 0.24±0.05,P < 0.01）,TPL含量明显降低（0.29±0.04 VS 0.38±0.06,P < 0.05）。与LPS组比较,LPS+NaHS高剂量组BALF中TP含量明显降低,LPS+NaHS中、高剂量组BALF中TPL含量明显升高（P < 0.05）。与LPS组比较,LPS+PPG组BALF中TP含量明显升高,TPL含量明显降低（0.43±0.04 VS 0.24±0.05,0.24±0.03 VS 0.29±0.04,P < 0.05）。结论:ALI早期给予NaHS后,SP-A和SP-B mRNA基因表达上调,TP生成降低,TPL生成增加,肺损伤减轻。给予PPG后,SP-A、SP-B和SP-C mRNA基因表达下调,TP生成增加,TPL生成降低,肺损伤加重。
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