防风有效成份抗动脉粥样硬化炎性反应的实验研究

论文摘要

动脉粥样硬化（AS）是许多心血管病与脑卒中的诱发因素，其病因复杂；从19世纪中叶到20世纪70年代，Virehow、Dugwid等分别提出了动脉炎性损伤学说、脂源性假说，从不同角度解释了AS的形成机制。但进入20世纪90年代，对于动脉粥样硬化病理生理机制的理解发生了重大改变，超越了动脉粥样硬化是血管进行性阻塞这一传统观念的局限，Ross以新的论据在他损伤反应学说的基础上，明确提出：动脉粥样硬化是一种炎症性疾病而不是单纯的由于脂质沉积所致。随着对动脉粥样硬化发生机制的深入研究，炎症在AS形成中的作用已被越来越多的资料所证实，可以认为AS是以慢性炎症过程为基础，炎性细胞因子、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及免疫因素等环节共同参与的综合发生发展过程，为AS治疗学的进步及未来关于AS的理论研究提出了新思路。在中医学中，有关AS的临床辩证分别归属于心悸、胸痹心痛，治疗多采用活血化瘀等具有综合调节功效的方剂，治疗过程中体现了中药多靶点、多环节、整体调节的作用特点，与AS发生机制的理论变革有密切相关性。防风是具有疏风解表、辛温通阳作用的风药，新近研究表明，风药具有活血化瘀的功效，开展防风抗AS的研究，有助于丰富中医风药活血的理论内涵。现代药理研究表明，防风具有显著的抗炎活性，进一步研究发现，升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷是防风主要的抗炎成分，现已作为防风药材质量标准的定性、定量标准。因此，本研究项目从中西医结合的理论出发，根据AS的发生发展规律，针对炎性因子、血管内皮细胞、平滑肌细胞等综合因素在AS发生中的相互作用，研究升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对AS炎性反应的影响，为拓展中医风药的临床应用提供科学依据。根据Ross的AS炎症假说，ox-LDL等诱发因素引起血管内皮损伤或功能障碍，刺激内皮细胞、巨噬细胞等释放IL-6、TNF-α等炎性因子，这些炎症因子继而刺激平滑肌细胞的增殖，最终导致AS斑块的形成与发展。本研究采用体外ox-LDL损伤血管内皮细胞模型、促黏附模型及TNF-α刺激平滑肌细胞增殖模型，探讨升麻苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷抗AS炎性反应，研究工作主要包括以下三个方向：1升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对于ox-LDL所致心肌微血管内皮细胞生存率和分泌炎性细胞因子的影响参照Nishida等的方法，建立了大鼠乳鼠心肌微血管内皮细胞体外培养方法。采用免疫荧光法对心肌微血管内皮细胞进行了鉴定，并用细胞计数法绘制了细胞的生长曲线。在掌握乳鼠心肌微血管内皮细胞的生长特性后，选用第三代内皮细胞，进行下一步实验。通过测定升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷对内皮细胞活性的影响，确定升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷的实验浓度；通过测定ox-LDL对内皮细胞存活率的影响，确定ox-LDL造成内皮细胞损伤的造模浓度；然后通过MTT法测定了升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷预处理后，对ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤的影响，并分别采用ELISA与放免法的方法，测定了升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷对ox-LDL致心肌微血管内皮细胞分泌炎性细胞因子的影响。实验结果如下：①免疫荧光法鉴定所培养的乳鼠心肌微血管内皮细胞因子Ⅷ相关抗原阳性，结合细胞呈单层铺路石样生长的形态学特征，可确定培养的细胞为心肌微血管内皮细胞；②根据绘制细胞生长曲线，以一定细胞密度铺板(1×105·mL-1)，在铺板后24h-72h之间细胞处于指数增长期，是进行实验的最佳时期；③采用MTT法测定升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷对内皮细胞活性的影响，结果发现升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷毒性较小，测不出对内皮细胞的最大无毒浓度，因此选择50μg·ml-1、100μg·ml-1、200μg·ml-1三个浓度作为升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷的实验浓度；④采用MTT法测定ox-LDL对内皮细胞存活率的影响，确定在MDA含量为3ng·ml-1的ox-LDL作用下，内皮细胞损伤较明显，可建立稳定的内皮细胞损伤模型，故选用此浓度作为ox-LDL的造模浓度。⑤采用MTT法测定升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷预处理后，对ox-LDL导致的血管内皮细胞生存率的影响，结果表明MDA含量为3nmol·ml-1的ox-LDL能够明显降低内皮细胞存活率，使模型组细胞吸光值明显下降，与空白组相比差异极显著（P＜0.01）。升麻苷200μg·ml-1，5-O甲基维斯阿米醇苷50μg·ml-1、100μg·ml-1、200μg·ml-1均能明显抑制ox-LDL引起的内皮细胞损伤，与ox-LDL组相比差异极显著（P＜0.01）。升麻苷50μg·ml-1、100μg·ml-1具有减轻ox-LDL损伤作用的趋势，但与ox-LDL组相比，差异不显著。⑥采用ox-LDL(MDA含量为3nmol·ml-1造成血管内皮细胞损伤，升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷(浓度均分别为50μg·ml-1、100μg·ml-1、200μg·ml-1预处理，观察这两种药物对ox-LDL诱导血管内皮细胞炎性因子释放的影响，结果表明：ox-LDL能够明显增加内皮细胞IL-6、TNF-α的分泌量，与空白组相比差异极显著（P＜0.01）。升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷100μg·ml-1、200μg·ml-1组均能明显抑制ox-LDL引起的内皮细胞分泌IL-6，与模型组相比差异显著（P＜0.05）：升麻苷三个剂量组和5-O甲基维斯阿米醇苷200μg·ml-1组能明显抑制Ox-LDL引起的内皮细胞分泌TNF-α，与模型组相比差异极显著（P＜0.01）。2升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对于心肌微血管内皮细胞与单核细胞黏附的影响参照Nishida等的方法，建立了大鼠乳鼠心肌微血管内皮细胞体外培养方法，采用第三代内皮细胞，观察升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷对ox-LDL诱导血管内皮细胞与单核细胞黏附性的影响。实验结果如下：采用MDA含量为3nmol·ml-1的ox-LDL增加血管内皮细胞对单核细胞的黏附性，并用升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷(浓度均分别为50μg·ml-1、100μg·ml-1、200μg·ml-1)预处理，观察这两种药物对ox-LDL诱导血管内皮细胞黏附性增加的影响，结果表明：ox-LDL能明显增加单核细胞与内皮细胞的黏附，与空白组相比，差异极显著（P＜0.01）。升麻苷50μg·ml-1、100μg·ml-1、200μg·ml-1，5-O甲基维斯阿米醇苷200μg·ml-1均能明显抑制ox-LDL引起的单核细胞与内皮细胞的黏附，与模型组相比差异极显著（P＜0.01）。5-O甲基维斯阿米醇苷50μg·ml-1、100μg·ml-1能明显抑制ox-LDL引起的单核细胞与内皮细胞的黏附，与ox-LDL组相比差异显著（P＜0.05）。3升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对于TNF-α所致大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响采用组织贴块法，建立了大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代培养方法。采用免疫化学方法对该细胞进行鉴定，并用细胞计数法绘制细胞生长曲线。根据细胞的生长特性，选用第三代平滑肌细胞，进行下一步实验。首先确定这两种药物的最大无毒浓度及实验浓度：然后确定TNF-α能够刺激平滑肌细胞的促增殖的造模浓度；通过MTT法测定升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对TNF-α刺激平滑肌细胞增殖的影响；用流式细胞仪测定这两种药物对平滑肌细胞增殖周期的影响。实验结果如下：①采用SABC法对平滑肌细胞进行肌动蛋白免疫组化染色，99％的细胞染色阳性，再结合细胞呈典型的“峰谷”状排列的形态学特征，可确定培养的细胞为胸主动脉平滑肌细胞；②通过绘制细胞生长曲线，确定以一定密度(1x105·mL-1)铺板后，24h-96h为该细胞的指数增长期，选择这段时间进行实验；③通过观察不同浓度升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对平滑肌细胞活性的影响，发现这两种药物毒性较小，测不出对平滑肌细胞的最大无毒浓度，因此选择50μg·ml-1、100μg·ml-1、200μg·ml-1三个浓度作为升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷的实验浓度；④通过观察TNF-α对平滑肌细胞增殖的影响，发现5ng·ml-1的TNF-α促增殖作用最明显，因此选择5ng·ml-1作为TNF-α的造模浓度；⑤采用5ng·ml-1的TNF-α诱导血管平滑肌细胞增殖，用升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷(浓度均分别为50μg·ml-1、100μg·ml-1、200μg·ml-1)进行处理，观察这两种药物对TNF-α诱导的平滑肌细胞增殖的作用，结果表明：5ng·ml-1TNF-α能明显刺激平滑肌细胞增殖，与空白组相比差异极显著（P＜0.01）。升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷三个剂量组均能明显抑制TNF-α引起的平滑肌细胞增殖，与TNF-O组相比差异极显著（P＜0.01）；⑥采用5ng·ml-1的TNF-α诱导血管平滑肌细胞增殖，用升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷(浓度均分别为50μg·ml-1、100μg·ml-1、200μg·ml-1)进行处理，观察这两种药物对平滑肌细胞周期的影响。结果表明5ng·ml-1TNF-α能明显增加平滑肌细胞G2期与S期比例，与空白组相比差异极显著（P＜0.01）。升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷均使G1／G1期细胞比例增加，S期、G2／M期细胞比例减少，与TNF-α组相比差异极显著（P＜0.01）。从以上结果可以看出，升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷具有抑制ox-LDL刺激血管内皮细胞引起的损伤及炎性因子释放、抑制ox-LDL引起的单核细胞与内皮细胞黏附性增高、抑制TNF-α引起的平滑肌细胞增殖的作用，总的来说，升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷具有抗AS炎性反应的作用，为升麻苷与5-O甲基维斯阿米醇苷发展成为抗AS的药物，提供了实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 实验设计示意图
• 文献综述
• 1 动脉粥样硬化发生机制的研究进展
• 2 动脉粥样硬化的炎症假说
• 3 炎症的始动因素
• 4 动脉粥样硬化炎性反应的信号调节
• 5 干预动脉粥样硬化炎症反应的药物研究
• 前言
• 第一部分 升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对于ox-LDL所致心肌微血管内皮细胞生存率和分泌炎性细胞因子的影响
• 前言
• 1.大鼠乳鼠心肌微血管内皮细胞原代培养方法的建立
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 2.升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷给药剂量的确定
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 3 氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）造模浓度的确定
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 4 升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷对于心肌微血管内皮细胞存活率的影响
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 5 升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷对于心肌微血管内皮细胞分泌炎性细胞因子的影响
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 第二部分 升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷对于心肌微血管内皮细胞与单核细胞黏附的影响
• 前言
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三部分 升麻苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对于TNF-α所致大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响
• 前言
• 1.大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代培养方法的建立
• 1.1 材料
• 1.2 方法:
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 2.升麻苷和5-O甲基维斯阿米醇苷给药剂量的确定
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 3.肿瘤坏死因子（TNF-α）造模浓度的确定
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 4.升麻苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对于TNF-α所致大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 5.升麻苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对于大鼠胸主动脉平滑肌细胞周期的影响
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 结语
• 文献综述参考文献
• 实验研究参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 附图