论文摘要
表皮葡萄球菌是重要的医院内感染病原菌,它引起的感染主要是在一些植入人体的医疗器械表面形成生物膜,并造成持续性感染。以往报道ClpP蛋白酶在细菌耐受应激环境、致病和形成生物膜等方面发挥作用,为了研究ClpP蛋白酶在表皮葡萄球菌中的功能,我们构建了一株表皮葡萄球菌clpP突变菌株。与野生菌株相比,clpP突变菌株生物膜形成能力显著下降。我们将表皮葡萄球菌clpP基因克隆到质粒上,然后转化入clpP突变菌株,得到的基因互补菌株生物膜形成能力回复到野生菌株的水平。我们将表皮葡萄球菌clpP基因点突变,使它编码的蛋白失去肽酶的功能,然后将突变的clpP基因同样克隆到质粒上并转化入clpP突变菌株,得到的菌株生物膜形成能力不能回复。这些结果表明表皮葡萄球菌生物膜形成需要ClpP蛋白酶的功能。与野生菌株相比,clpP突变菌株对高分子材料的粘附能力显著下降,并且细胞间粘附因子PIA的合成量减少,这两个表型变化可能是突变菌株生物膜形成能力下降的原因。通过比较表皮葡萄球菌agr突变菌株与野生菌株的clpP基因转录水平,我们发现ClpP受agr细菌数量感应系统负调控。以往发现agr细菌数量感应系统对表皮葡萄球菌粘附高分子材料的能力具有负调控作用,我们的研究结果提示agr系统有可能通过调控ClpP而调控表皮葡萄球菌对高分子材料的粘附。与野生菌株相比,clpP突变菌株生长减慢,并且对氧化应激的耐受能力下降,这些研究结果表明表皮葡萄球菌正常生长和耐受氧化应激均需要ClpP蛋白酶的功能。我们用大鼠中央静脉插管感染模型比较clpP突变菌株与野生菌株引起插管相关感染的致病能力,结果显示clpP突变菌株较不容易引起插管相关感染,这表明ClpP蛋白酶的功能有助表皮葡萄球菌引起插管相关感染。(第一部分)已知细菌Spx蛋白是一种功能多样的基因转录调控蛋白,在一般生理条件下受到ClpP蛋白酶的降解而维持相对较低的蛋白质水平。在金黄色葡萄球菌中,Spx蛋白对生物膜形成有负调控作用。我们推测在表皮葡萄球菌中Spx蛋白同样对生物膜形成有调控作用,ClpP蛋白酶可能通过降解Spx蛋白而影响表皮葡萄球菌生物膜形成。为了研究表皮葡萄球菌中Spx蛋白是否受ClpP蛋白酶降解,我们比较表皮葡萄球菌clpP突变菌株与野生菌株Spx蛋白的水平,结果发现Spx蛋白在clpP突变菌株中显著增加,这验证了表皮葡萄球菌Spx蛋白是ClpP蛋白酶的降解底物。为了研究Spx蛋白水平提高是否影响表皮葡萄球菌生物膜形成,我们通过构建和转化表达质粒,在表皮葡萄球菌中过量表达Spx蛋白,然后检测生物膜形成能力是否发生变化。与对照菌株相比,Spx过量表达的菌株生物膜形成能力显著下降,这表明Spx蛋白负调控表皮葡萄球菌生物膜形成。深入研究发现,Spx过量表达的菌株对高分子材料的粘附能力显著下降、PIA合成相关基因ica操纵子转录水平降低、PIA的合成量减少,这些可能是Spx过量表达的菌株生物膜形成能力下降的原因。由于相比表皮葡萄球菌野生菌株,clpP突变菌株中Spx蛋白显著增加,并且我们发现在表皮葡萄球菌野生菌株中过量表达Spx会抑制生物膜形成,因此论文第一部分中发现的clpP突变菌株生物膜形成能力下降至少部分原因是Spx蛋白堆积进而抑制生物膜的形成。我们的研究结果表明,降解Spx蛋白是ClpP影响表皮葡萄球菌生物膜形成的途径之一。(第二部分)
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