论文摘要
近年来由酒精引发疾病问题日益严重,越来越多的研究已开始涉及预防和治疗酒精所引发的肝损害。二至丸由女贞子和墨早莲两味药组成,具有补益肝肾的功效,目前尚未有报道其对酒精性肝损伤保护作用的研究。本论文对二至丸进行质量控制,并鉴定了其中有效成分,探索其对酒精性肝损伤的保护作用。研究内容主要包括以下几个部分:（一）文献研究查阅国内外相关文献,对目前酒精性肝损伤的研究进展以及代谢组学技术在肝肾损伤中的应用情况进行了综述。（二）高效液相色谱法同时测定二至丸中4种成分的含量建立同时测定二至丸中女贞苷、特女贞苷、蟛蜞菊内酯、齐墩果酸的含量的高效液相色谱法。采用DIKMAC18柱（200mm×4.6mm,5μm）,流动相为乙腈—磷酸水,梯度洗脱,流速1.0 mL · min-1,进样体积20μL,柱温30℃,检测波长215 nm。结果发现女贞苷、特女贞苷、膨蜞菊内酯、齐墩果酸的质量浓度与峰面积分别在2.008～80.32 μg mL-1（r=0.999 6）,5.872～234.88 μg.mL.1（r=0.999 7）,0.9～36 μg mL-1（r=0.999 9）,13.24～529.6μg·mL-1（r=0.999 6）范围内呈良好线性;平均回收率分别为99.25%,98.70%,96.23%,101.45%,RSD 均小于 3%。（三）二至丸及其组方药物水煎液的RRLC-TOF/MS成分分析通过高分离度快速液相-飞行时间质谱（RRLC-TOF/MS）联用技术定性分析二至丸及其处方药中的主要化学成分,二至丸水提液、女贞子水提液、墨旱莲水提液中分别鉴定出15个、12个、7个成分,主要为环烯醚萜类、三萌类、黄酮类的成分,这为今后的物质基础研究奠定了基础。（四）二至丸对酒精诱导的大鼠肝损伤的保护作用研究雄性Wistar大鼠预防性给药7天后,以乙醇灌胃法建立大鼠急性酒精性肝损伤模型,造模和给药同时进行,末次灌胃后24h取大鼠血清,检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乙醇脱氢酶（ADH）甘油三酯（TG）和肝匀浆超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量,观察肝脏病理形态学改变。结果显示,与空白对照组相比,模型组血清ALT、AST、ADH及TG活性明显升高,有显著性差异（P<0.01）,表明模型制备成功;各给药组ALT、AST、ADH指标的升高被显著抑制,与模型组相比有差异（P<0.01或P<0.05）;TG只有阳性组和二至丸高剂量组与模型组有差异（P<0.01或P<0.05）。与空白对照组相比,模型组肝匀浆中MDA含量明显升高,SOD含量下降,具有显著性差异（P<0.01）,二至丸高剂量、中剂量组MDA的升高被显著抑制,与模型组相比有差异（P<0.01或P<0.05）,阳性组和低剂量组组无显著性差异（P>0.05）;阳性组及二至丸高剂量、中剂量SOD的下降被明显抑制,与模型组相比有差异（P<0.05）,低剂量组组无显著性差异（P>0.05）。通过病理学切片观察,二至丸高、中、低剂量均能显著改善肝组织的病理变化,以二至丸高剂量效果最好。将二至丸水提液依次用不同溶剂萃取,经干燥后得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和萃余液四个部位浸膏,加水溶解配制溶液。取70只雄性Wistar大鼠随机分为7组,以乙醇灌胃法建立酒精性肝损伤模型,检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乙醇脱氢酶（ADH）甘油三酯（TG）、血清内毒素、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素18（IL-18）的活性和肝匀浆超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量,观察肝脏病理形态学改变。结果显示,与空白对照组相比,模型组血清ALT、AST、ADH、TG、血清内毒素、TNF-α、IFN-γ及IL-18活性明显升高,有显著性差异（P<0.01）,表明模型制备成功;各给药组这些指标的升高被显著抑制,与模型组相比有差异（P<0.01或P<0.05）。与空白对照组相比,模型组肝匀浆中MDA含量明显升高,SOD含量下降,具有显著性差异（P<0.01）,阳性组、石油醚组和乙酸乙酯组MDA的升高被显著抑制,与模型组相比有差异（P<0.01或P<0.05）,正丁醇组和萃余液组无显著性差异（P>0.05）;阳性组、乙酸乙酯组、正丁醇组和萃余液组SOD的下降被明显抑制,与模型组相比有差异（P<0.01或P<0.05）,石油醚组无显著性差异（P>0.05）。通过病理学切片观察,各给药组均一定程度能显著改善肝组织的病理变化。（五）二至丸对大鼠急性酒精肝损伤尿液和胆汁的代谢组学研究研究大鼠酒精性肝损伤模型大鼠尿液和胆汁中内源性代谢物的变化和二至丸对异常代谢的调节作用,寻找可能的生物标志物,以探索二至丸治疗酒精性肝损伤的作用机制。将Wistar大鼠分为空白组、模型组和二至丸给药组,采药红星二锅头复制酒精肝损伤模型。运用快速分离液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（RRLC-Q-TOF/MS）技术,对各组大鼠尿液和胆汁进行了正、负离子扫描,采用单因素方差分析（ANOVA）与正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）结合的方法对多变量数据进行分析。模式识别中能够较好的区分三组大鼠的尿液和胆汁数据变量,根据VIP数值的大小筛选出对分类有显著贡献的离子,t检验方法进行显著性统计分析。在尿液中鉴定出苯基丙酸、尿苷等11种潜在代谢生物标志物,这些内源性物质在给药组大鼠体内均得到了不同程度的恢复。通过独特通路分析（IPA）,找到4条肝损伤代谢通路。在胆汁中鉴定出胆汁酸、氨基酸、溶血磷脂类的10种潜在代谢生物标志物,这些内源性物质在给药组大鼠体内均得到了不同程度的恢复。通过独特通路分析（IPA）,找到8条肝损伤代谢通路,可能与二至丸的保护作用有关。代谢组学不仅可以帮助预测酒精性肝疾病的发生,而且为监测疾病状态下体内代谢物的变化提供了一定的依据。