稳定同位素碘标记-ICP-MS在免疫分析中的应用

论文摘要

随着生命科学的进步,免疫分析法获得了不断的发展。近来,电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）在免疫分析中成为人们关注的一个检测手段。由于电感耦合等离子体质谱具有灵敏度高、检出限低、线性动态范围宽、干扰较少等优点,并可以进行多元素同时快速分析,因此在高通量的生物免疫检测方面具有广泛的应用前景。本工作中研究了稳定同位素碘标记蛋白技术,建立了电感耦合等离子体质谱免疫碘标记蛋白分析方法,并将该法应用到特异性免疫蛋白检测和致病性菌检测中。论文共有四个部分组成:1.文献综述;2.稳定性同位素碘标记蛋白;3.碘-127标记-电感耦合等离子体质谱用于免疫分析;4.蒸气发生-电感耦合等离子体质谱法测定碘。第一章通过文献综述介绍了免疫分析方法的发展状况及其在各领域的应用,阐述了免疫分析的标记方法及进展,并对免疫分析发展趋势作了扼要论述,突出了电感耦合等离子体质谱在免疫分析应用中的可行性。第二章研究稳定性同位素碘-127标记蛋白的方法。介绍了不同的碘标记方法及其发展情况,并对各种碘的标记方法进行了比较;研究中采用溴代琥珀酰亚胺法实现非放射性碘-127对蛋白的标记:溴代琥珀酰亚胺是一种比较温和的氧化剂,并在均相中进行反应,标记反应步骤简便,标记率高、标记物稳定、活性好,实验证明是一种理想的碘标记方法。第三章主要介绍了稳定性碘标记-电感耦合等离子体质谱用于免疫蛋白分析。研究中首先以兔抗大肠杆菌为抗原,羊抗兔IgG蛋白为抗体,对羊抗兔IgG蛋白进行碘标记,然后进行免疫反应,以电感耦合等离子质谱进行检测,建立了免疫蛋白检测的碘-127标记-电感耦合等离子体质谱免疫分析法。另外,对免疫微孔板进行了修饰实验;建立检测前碘标化合物的处理方法,防止碘的挥发和碘的记忆效应。最后,使用该方法对致病性菌的免疫蛋白分析作了尝试,获得一定理想的效果。第四章主要建立了一种在线化学蒸气发生-电感耦合等离子体质谱测定碘的方法,利用碘负离子的还原性,采用氧化还原手段,将碘负离子氧化为碘单质;然后通过碘单质的易挥发特点,将碘蒸气直接导入等离子体。即采用化学蒸气发生法（Chemical Vapour Generation）进行进样,与传统的雾化进样相比,能更有效地引入样品,提高了样品传输效率和检测灵敏度。该方法的建立还对碘的形态作了尝试,对碘负离子和碘酸盐进行检测。本研究工作的创新点:1.为电感耦合等离子体质谱检测法与免疫方法相结合完成了非放射性碘127标记蛋白的研究。实验中采用溴代琥珀酰胺（NBS）法,实现了稳定性同位素碘标记蛋白方法的建立;方法采用非放射碘标记,克服了传统方法中碘放射性对操作者带来的危害和困难等。2.将电感耦合等离子体质谱检测法与免疫方法相结合,建立了免疫蛋白检测的碘-127标记-电感耦合等离子体质谱免疫分析法,并实现该方法在特异性免疫蛋白检测和致病菌检测中的应用。3.建立一种在线化学蒸气发生-电感耦合等离子体质谱测定碘的方法。即采用化学蒸气发生法（Chemical Vapour Generation）进行进样,能更有效地引入样品,提高了样品传输效率和检测灵敏度。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文章综述
• 1 引言
• 2 标记免疫分析
• 2.1 放射分析技术和非同位素标记
• 2.1.1 放射免疫分析的基本试剂
• 2.1.2 放射性同位素的选择
• 2.1.3 放射免疫分析（RIA）的优点
• 2.1.4 放射免疫分析（RIA）的缺点
• 2.2 酶免疫分析
• 2.2.1 类型
• 2.2.2 原理
• 2.3 荧光免疫分析
• 2.3.1 类型
• 2.4 发光免疫分析
• 2.4.1 类型
• 2.4.2 原理
• 2.4.3 发光免疫分析优点
• 2.5 金属离子免疫分析
• 3 标记化合物物的免疫活性
• 3.1 免疫活性测定的重要性
• 3.2 标记化合物的免疫活性测定方法
• 4 影响标记免疫分析的因素
• 5 标记免疫分析的标准化问题
• 5.1 标准化研究的进展
• 5.2 常用“标准化”方法及局限性
• 6 标记免疫分析的发展趋势
• 6.1 抗体
• 6.2 标记方法
• 6.3 多元标记免疫分析
• 6.4 标记免疫分析的自动化
• 7 电感耦合等离子体质谱与免疫分析
• 8 本工作设想
• 参考文献:
• 第二章 稳定性同位素碘标记蛋白
• 1 引言
• 2 蛋白质与多肽激素的放射性碘标记方法
• 2.1 氯胺T法
• 2.1.1 原理
• 2.1.2 标记步骤
• 2.1.3 注意事项
• 2.2 乳过氧化物酶法（LPO）
• 2.2.1 原理
• 2.2.2 标记步骤
• 2.2.3 注意事项
• 2.3 酰化试剂（Bolton和Hunter试剂）法
• 2.3.1 原理
• 2.3.2 标记步骤
• 2.4 Iodogen碘化法
• 2.4.1 原理
• 2.4.2 方法
• 2.4.3 注意事项
• 125I-蛋白与¹²⁵I纯化与鉴定'>3 标记反应液中¹²⁵I-蛋白与¹²⁵I纯化与鉴定
• 4 碘标记蛋白的贮存
• 5 稳定性碘标记
• 5.1 方法与原理
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 仪器和试剂
• 127I标记蛋白'>5.2.2 非放射性¹²⁷I标记蛋白
• 5.2.3 紫外分光光度测定标记后蛋白浓度和计算标记比
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 溴代琥珀酰胺法（NBS）标记蛋白及分离
• 5.3.2 氧化剂用量对标记的影响
• 5.3.3 反应时间对标记的影响
• 5.3.4 温度因素
• 5.3.5 反应体积因素
• 5.3.6 pH的影响
• 5.3.7 碘标记羊抗兔蛋白稳定性
• 6 小节
• 参考文献
• 第三章 碘127标记-电感耦合等离子体质谱用于免疫分析
• 第一节 碘标记-电感耦合等离子体质谱免疫分析法的建立
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器和试剂
• 2.2 等离子体质谱仪工作条件
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 聚苯乙烯板的修饰
• 2.3.2 兔抗大肠杆菌的包被
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 聚苯乙烯微孔板的修饰
• 2.4.1.1 不同处理的PS板的蛋白吸附效果
• 2.4.1.2 紫外灯照射PS板时间影响
• 2.4.2 PS板封闭研究
• 2.4.3 免疫反应实验
• 2.4.3.1 方法
• 2.4.3.2 方法的检出限及重现性
• 2.4.4 标记碘的解脱
• 2.4.4.1 氨水浓度对溶解碘的影响
• 2.4.4.2 时间对氨水溶解碘的影响
• 2.4.5 ICP-MS测定碘
• 第二节 碘标记-电感耦合等离子体质谱法应用于细菌检测
• 1 引言
• 2 方法原理
• 2.1 IgG分离提纯方法
• 2.2 免疫板上细菌抗原的固定
• 3 实验部分
• 3.1 仪器与试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 抗体提纯
• 3.2.2 纯化蛋白的碘标记
• 3.2.3 细菌的固定及与碘标蛋白的反应
• 4 结果与讨论
• 4.1 盐析法-蛋白A亲和层析法提纯抗体蛋白
• 4.2 溴代琥珀酰胺法（NBS）标记蛋白及分离
• 4.3 3种致病菌的检测
• 4.4 抗体特异性实验
• 参考文献
• 第四章 蒸气发生-电感耦合等离子体质谱法测定碘
• 1 引言
• 2 实验部分
• 1.1 仪器与试剂
• 1.2 碘蒸气产生流程图
• 1.3 等离子体质谱工作条件
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 化学蒸气发生
• 1.4.2 标准曲线制作
• 1.4.3 方法检出限及重现性
• 2 结果与讨论
• 2.1 载气流量
• 2.2 样品的进样量
• 2.3 酸及氧化剂的选择
• 2.5 样品加标回收率
• 2.6 高价碘检测
• 2.6.1 碘酸根离子检测
• 2.6.2 抗坏血酸影响
• 3 小结
• 参考文献
• 附录：攻读硕士期间发表论文
• 致谢