雌激素受体亚型对卵巢癌增殖和侵袭的影响

论文摘要

卵巢癌已成为我国城市女性发病率和病死率最高的生殖道恶性肿瘤，严重威胁着广大妇女的生命健康。卵巢既可以产生雌激素，又是雌激素作用的靶器官。大量的临床和基础研究提示雌激素可能与卵巢癌的发病有关。雌激素主要是通过核受体超家族的成员，雌激素受体（estrogen receptor，ER）发挥作用。随着ERα的克隆成功，其结构和转录调节功能也不断地得以阐明，ERβ的发现更使人们对雌激素受体的传统观念发生了根本的变化。雌激素在卵巢癌发生发展中的地位特殊而复杂，不同的雌激素受体亚型在这种特殊而复杂的关系中很可能扮演着关键的角色。 第一部分 ERβ在卵巢透明细胞癌细胞系ES-2增殖和侵袭中的作用 目的：了解ERβ在人卵巢透明细胞癌细胞系ES-2增殖和侵袭中的作用，探讨其在肿瘤发生发展中的可能地位。 方法：通过基因稳定转染技术，构建ERβ稳定表达的ES-2细胞株，RT-PCR和Western blot鉴定ERβ的表达；MTT法和动物皮下接种观察ERβ在体内体外对ES-2生长的影响；流式细胞分析、Brdu摄入实验了解转染ERβ后在17β—雌二醇E2刺激下ES-2细胞周期、细胞体外增殖的改变；体外侵袭实验分析ERβ在ES-2细胞活动侵袭中的作用；RT-PCR、Western blot、明胶酶谱检测肿瘤增殖、侵袭相关指标以了解ERβ的功能。 结果：通过稳定转染方法获得ERβ阳性表达的人卵巢透明细胞癌ES-2细胞，分别为ESβ1和ESβ2，同时转染空质粒获得载体对照ESVE细胞。体内体外生长曲线检测表明转染了ERβ的ESβ细胞生长明显落后于ES-2细胞和ESVE细胞，P＜0.01；雌激素作用后，ES-2细胞的S期比例为37.10％±9.04％，ESVE细胞为39.18％±9.91％，ESβ1的S期比例为19.71％±5.31％，P＜0.05，ESβ2为22.27％±6.64％，P＞0.05：同时伴随着ESβ1和ESβ2细胞周期蛋白Cyclin D1 mRNA（分别为ESVE细胞表达量的50.50％±0.95％和50.83％±1.62％）和蛋白（分别为ESVE细胞表达量的41.00％±2.88％和42.47％±1.50％）表达的减少，P＜0.01；Brdu摄入实验中ESβ细胞的阳性细胞比例为12.03％±0.81％，较ES-2细胞（32.03％±1.79％）和ESVE细胞（32.20％±1.65％）低，P＜0.01。体外侵袭实验ESβ细胞24h、48h、72h穿过transwell小室的细胞数分别为21.66±5.03、38.33±9.07、54.33±14.01，少于ES-2细胞（分别为68.00±7.00、101.67±17.47、333.00±25.53）和ESVE细胞（分别为77.33±8.02、127.67±15.01、366.00±26.51），P＜0.01；同时ESβ1和ESβ2细胞MMP2 mRNA表达（分别为ESVE细胞的25.70％±0.26％、27.23％±0.75％）及分泌（分别为ESVE细胞的49.80％±1.35％、50.77％±1.66％）减少，P＜0.01，E钙粘蛋白mRNA（分别为ESVE细胞的300.83％±25.75％、295.67％±40.08％）和蛋白（分别为ESVE细胞的526.20％±25.12％、522.37％±22．30％）表达增加，P<0．01。 结论：稳定表达ER D的卵巢透明细胞癌细胞系ES-2体内体外增殖能力明显减弱，同时也影响细胞体外侵袭能力，提示ER β对雌激素发生反应，并产生肿瘤抑制作用。 第二部分 雌激素受体α在雌激素对卵巢癌细胞survivin表达调节中的作用 目的：研究雌激素、雌激素受体α对卵巢癌细胞survivin表达的可能影响。 方法：RT-PCR和Western blot检测卵巢癌细胞系NIH：OVCAR-3、SKOV-3中ERα的表达情况；RT-PCR和Western blot检测NIH：OVCAR-3细胞分别在溶剂对照、17β—雌二醇、雌激素受体拮抗剂ICI182780+17β—雌二醇作用后survivin mRNA和蛋白的表达情况；通过脂质体转染，建立过度表达ERα的SK-ERα细胞，RT-PCR和Western blot检测SKOV-3、SK-ER α及空质粒对照SK-pcDNA细胞在雌激素作用下survivin mRNA和蛋白的表达情况。 结果：卵巢癌细胞系NIH：OVCAR-3、SKOV-3中ERα mRNA均为弱阳性表达；NIH：OVCAR-3 ERα蛋白亦为弱阳性表达，而SKOV-3细胞中ERα蛋白阳性不明显，经过稳定转染获得ERα mRNA和蛋白过度表达的SK-ERα细胞及空质粒对照的SK-pcDNA细胞。雌激素作用后，NIH：OVCAR-3细胞survivin mRNA表达是溶剂对照组的1.07±0.01倍，P＜0.01，survivin蛋白表达是溶剂对照组的1.06±0.05倍，P＞0.05；而ICI182780处理后再经雌激素作用，survivin mRNA和蛋白的表达明显减弱，P＜0.01。在雌激素作用下，SK-ERα细胞是SKOV-3细胞survivin蛋白表达量的2.76±0.55倍，P＜0.01，而ICI182780处理后再经雌激素作用，SK-ERα细胞中survivin蛋白表达量不如单用雌激素组，P＜0.05。 结论：雌激素通过雌激素受体α促进卵巢癌细胞的survivin表达。 第三部分 Survivin对卵巢癌细胞系SKOV-3体外侵袭的影响 目的：探讨凋亡蛋白抑制基因survivin在人卵巢癌细胞系SKOV-3体外侵袭中的可能作用及其发挥作用的可能途径。 方法：运用siRNA技术，建立survivin表达减少的SKOV-3细胞克隆，RT-PCR和Western blot进行鉴定、划痕实验和体外侵袭实验检测survivin表达量不同的细胞移动和侵袭能力、RT-PCR和明胶酶谱法了解survivin对MMP9表达和分泌的调节作用。 结果：通过siRNA载体转染获得survivin低表达的卵巢癌细胞克隆SKⅡ细胞及无义干扰对照SKNE细胞。RT-PCR及Western blot检测SKⅡ细胞中survivin mRNA和蛋白的表达分别为SKNE细胞的17.30％±0.50％和18.50％±0.75％，P＜0.01。进一步的结果显示SKⅡ细胞在划痕实验中的移动能力以及体外穿越Matrigel和聚碳酸酯膜的侵袭能力明显较亲代的SKOV-3细胞及对照的SKNE细胞弱，P＜0.01。另外抑制survivin表达也可引起MMP9 mRNA表达和分泌的减少，P＜0.01。 结论：siRNA抑制卵巢癌细胞系SKOV-3中survivin的表达可削弱肿瘤细胞在体外的移动和侵袭能力，这种作用可能与MMP9表达和分泌降低相关。 本研究结果提示ERβ可以抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭；ERα可以介导雌激素对survivin的上调，我们的研究进一步证明了survivin不但与肿瘤细胞的增殖有关，也影响了卵巢癌细胞的运动侵袭能力，因此，ERα可以以雌激素依赖方式促进卵巢癌细胞的增殖和侵袭。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 ERβ在卵巢透明细胞癌细胞系ES-2增殖和侵袭中的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 雌激素受体α在雌激素对卵巢癌细胞survivin表达调节中的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 Survivin对卵巢癌细胞系SKOV-3体外侵袭的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附录:
• 综述
• 致谢
• 发表文章
• 获奖情况