维生素C发酵中混菌机制及新型伴生菌系的研究

论文摘要

维生素C又叫L—抗坏血酸,是最重要的一类水溶性维生素之一,具有重要的生理功能,用途十分广泛。当前,我国维生素C产量巨大,占世界总产量的90%以上,产量80%以上出口。生产方法国内以“二步发酵法”、为主,即通过生黑葡萄糖酸杆菌（Acetobacter melanogenumr）将D-山梨醇氧化成L-山梨糖,此过程为第一步发酵,再经过混菌发酵体将L-山梨糖转化2-酮基-L-古龙酸,此过程为第二步发酵,再经过化学转化使2-酮基-L-古龙酸生成维生素C,其中第二步发酵中,是由两株不同菌混合发酵完成的,一株为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium俗称大菌）,另一株为普通生酮基古龙酸菌（Ketogulonigenium vulgare俗称小菌）,大小菌混合培养可以使98%以上山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸,而大小菌之间的基础生理关系依然不清,本研究的重点是进一步研究第二步发酵过程中混合菌之间的内在联系。主要研究结果表明:（1）大菌和小菌都可以单独培养,菌落生长良好,传代稳定:（2）大菌没有使L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸能力;小菌具有使L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸能力,发酵72h,转化率仅20%左右;（3）大小菌混合培养时,通过对发酵条件优化,L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸的能力明显提高,发酵48h,转化率达到95%以上:（4）将大菌单独培养后,分别研究大菌胞外液和胞内液对小菌生长和产酸的作用,结果表明大菌24h胞外液对小菌生长和产酸略有作用,可以使转化率达到23%,与小菌单独培养仅提高了3%,而大菌的胞内液没有促使作用,这与前人报道的结果有所不同,这个结果表明混合培养有更深的生物学机理:（5）在研究大小菌相互关系的过程中,首次发现了小菌对大菌生长的引导作用,即大菌沿着小菌的生长轨迹而趋向生长的现象,对照大肠杆菌则没有这种引导现象,进一步表明了大小菌伴生关系的复杂性;（6）筛选到一种能够促进小菌单独生长和产酸的物质AP1。其最适浓度为0.1%,小菌培养48h,2-酮基-L-古龙酸含量达到55.05mg/mL,是小单独培养条件下的3倍,转化率到达70%,同时小菌的活菌数增加约1.3倍。根据该物质的性质,推测小菌的产酸机理与氧化还原作用密切相关;（7）从土壤中筛选到一株芽孢菌B601,其对小菌的促使作用超过了巨大芽孢杆菌。在混合菌发酵中,发现其形成的芽孢数大于同条件下的巨大芽孢杆菌的芽孢数。在10%山梨糖底物下,B601作为伴生菌44h即达到发酵终点,与巨大芽孢杆菌（B.megaterium）相比提高底物L-山梨糖浓度,同时发酵周期也缩短;（8）对B601菌株作为伴生菌的新型菌系的培养条件与培养基进行优化,其结果如下:L-山梨糖10%、尿素0.6%、玉米浆1.0%、pH值6.8、培养温度30℃、装液量10%、接种量8%、种龄20h。与优化前培养基相比,L-山梨糖浓度提高了25%,尿素和玉米浆分别下降50%和33%,培养温度上升了2℃,同时发酵周期缩短了4h,转化率98%。本文的创新点有以下四点:（1）对大小菌之间伴生的生理关系有了更进一步研究,特别是证明了大菌单独培养所产生的胞内、胞外物质几乎没有促使小菌生长和产酸的作用,表明发酵过程中混菌培养的必要性和伴生作用的复杂性;（2）首次发现了小菌对大菌生长的促使作用:（3）首次找到一种促使小菌生长和产酸物质AP1;（4）从土壤中筛选到一株能更好促使小菌生长和产酸的伴生菌B601菌株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 维生素C的理化性质功能及应用
• 1.1.1 维生素C的理化性质
• 1.1.2 维生素C的生理功能
• 1.1.3 维生素C的应用
• 1.2 维生素C生产发展简介
• 1.2.1 浓缩提取
• 1.2.2 化学合成
• 1.2.3 生物发酵
• 1.3 维生素C重要前体—2-酮基-L-古龙酸研究进展
• 1.3.1 D-山梨醇途径
• 1.3.2 L-山糖途径
• 1.3.3 2,5-二酮基-D-葡萄糖酸途径
• 1.3.4 2-酮基-L-古龙酸途径
• 1.4 我国的二步发酵法研究现状
• 1.4.1 "二步发酵法"的第二步发酵中产酸菌与伴生菌的相互关系
• 1.4.2 第二步混合菌发酵工艺
• 1.5 本课题的科学意义与应用前景
• 第2章 仪器材料和实验方法
• 2.1 实验菌种
• 2.2 主要仪器
• 2.3 主要试剂
• 2.4 培养基
• 2.4.1 混合菌种的活化培养基
• 2.4.2 混合菌种的斜面及固体培养基
• 2.4.3 小菌的斜面及固体培养基
• 2.4.4 大菌培养基
• 2.4.5 种子培养基
• 2.4.6 发酵培养基
• 2.4.7 优化后发酵培养基
• 2.5 培养条件
• 2.5.1 种子培养
• 2.5.2 优化后种子培养
• 2.5.3 摇瓶发酵培养
• 2.5.4 优化后摇瓶发酵培养
• 2.6 分析方法
• 2.6.1 pH值测定
• 2.6.2 生长曲线的测定
• 2.6.3 L-山梨糖的测定
• 2.6.4 发酵液中2-KGA含量测定
• 2.7 大菌胞外液和胞内液的制备
• 2.8 土壤中芽孢菌的分离方法
• 第3章 维生素C第二步发酵混菌关系的研究
• 3.1 大、小菌生物学特性研究
• 3.1.1 发酵过程中菌体形态特征
• 3.1.2 大、小菌的生长及代谢的基本性质
• 3.2 大菌胞外液与胞内液对小菌生长和产酸作用的研究
• 3.2.1 混菌与小菌单独培养生长和产酸情况的研究
• 3.2.2 大菌胞外液对小菌生长和产酸影响
• 3.2.3 不同时间大菌胞外液对小菌生长和产酸的影响
• 3.2.4 大菌胞内液对小菌生长和产酸影响
• 3.3 小菌促使伴生菌生长的研究
• 3.4 筛选促使小菌生长和产酸物质的研究
• 3.4.1 混合物对小菌产酸作用的研究
• 3.4.2 单一物质对小菌产酸的研究
• 3.4.3 AP1和AP4对小菌生长影响
• 3.4.4 AP1不同浓度对小菌产酸的影响
• 3.4.5 AP1在小菌培养过程中对产酸和pH值的影响
• 3.5 本章小结
• 第4章 维生素C发酵中新型伴生菌系研究
• 4.1 土壤中芽孢菌的分离
• 4.2 从土壤中分离的芽孢菌产酸研究
• 4.3 B601菌株与巨大芽孢杆菌对小菌生长及产酸影响
• 4.4 巨大芽孢杆菌与B601菌株在发酵液中活菌和芽孢数的研究
• 4.5 B601新型菌系发酵条件优化研究
• 4.5.1 山梨糖浓度对新型伴生菌系的影响
• 4.5.2 尿素浓度对新型伴生菌系的影响
• 4.5.3 玉米浆浓度对新型伴生菌系的影响
• 4.5.4 装液量对新型伴生菌系的影响
• 4.5.5 pH值对新型伴生菌系的影响
• 4.5.6 接种量对新型伴生菌系的影响
• 4.5.7 培养温度对新型伴生菌系的影响
• 4.5.8 种子菌龄对新型菌系的影响
• 4.6 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的论文
• 致谢