共轭亚油酸两种主要异构体的分离及生理功能研究

论文摘要

c9，t11CLA和t10，c12CLA是共轭亚油酸最主要的两种异构体，具有多项生理功能。能防止和减轻初期癌症，降低人体内脂肪储存量，增加蛋白质的合成，提高人体的免疫能力等。研究表明，这两种异构体有不同的作用方式和机理。t10，c12CLA侧重在减脂增肌、防止肥胖、降低胆固醇、抗动脉粥样硬化及抗癌等方面，c9，t11CLA则可促进生长、提高饲料效率等。这两种异构体的分离技术，是深入进行CLA生理活性研究的前提。尽管对CLA的功能已有很多研究，但对CLA与血管内皮损伤和不同异构体共轭亚油酸对动脉粥样硬化的影响研究报道不多。本研究采用三种方法：优化尿素包合法、冷冻结晶法和生物酶法，对共轭亚油酸两种主要异构体进行了分离研究，完成了中试生产，通过动物实验，探讨了CLA对动脉粥样硬化的影响。主要结果如下：1、尿素包合法对共轭亚油酸两种异构体的分离结果中试规模尿素包后的液相中得到CLA的总量为93.68％，t10，c12CLA和c9，t11CLA两种异构体的比例达到2.34：1。尿素结晶中包合CLA的总含量为68.89％，c9，t11CLA：t10，c12CLA比例达1.54：1。2、冷冻结晶法对共轭亚油酸两种异构体的分离结果用乙醇作溶剂，-56℃对CLA乙酯进行冷冻分离，在乙醇与CLA乙酯的比例为18：1，反应120h时固相中得到t10，c12CLA：c9，t11CLA达16.07：1产品，远高于尿素包合法，收率为5.4％。当乙醇与CLA乙酯的比例为9：1时，冷冻31h后，冷冻结晶后所得液相中c9，t11CLA比t10，c12CLA的比例为1.63：1。回收率为82.6％。因此低温冷冻分离法适于生产两种异构体比例较高且附加值高的产品。3、酶催化酯化法对共轭亚油酸两种异构体的分离结果用脂肪酶Lipase AY 30进行异构体分离，优化反应条件，得CLA脂肪酸部分t10，c12CLA与c9，t11CLA的比例达2.63：1；CLA乙酯部分c9，t11CLA与t10，c12CLA的最高比可达4.72：1。说明酶催化分离两种CLA异构体，是一种非常有开发前途的技术。4、无溶剂体系酶促酯化反应合成共轭亚油酸甘油三酯的研究结果通过酯化反应，筛选4种固定化脂肪酶催化共轭亚油酸和甘油合成共轭亚油酸油脂。其中脂肪酶Novozym 435的催化酯化反应活性最高，反应酯化率可达94.11％。采用旋转筛筐法重复利用5次酯化率仍为87.28％。Novozym 435对共轭亚油酸异构体也有一定的选择性，但效果不如Lipase AY 30。5、共轭亚油酸对动脉粥样硬化的影响CLA在浓度1-5μmol／L的情况下，剂量和时间依赖性地刺激体外培养的VEC细胞生存率；可以部分阻断饱和脂肪酸PA、SA对血管内皮细胞的损伤作用，提高存活率。用上述中试实验得到的不同比例c9，t11CLA和t10，c12CLA共轭亚油酸产品，饲喂动脉粥样硬化模型大鼠8周，后实验结果表明实验组TG、TC、LDL均低于模型组，HDL较模型组高，且能升高SOD活性，降低MDA水平，显示不同异构体比例的共轭亚油酸能调节血脂，抗脂质过氧化损伤，减轻对动脉内膜的毒性。在一定程度上起到预防动脉粥样硬化形成的作用。为共轭亚油酸异构体的开发提供有价值的理论依据和生产手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 共轭亚油酸简介
• 1.1.1 共轭亚油酸的理化性质
• 1.1.2 共轭亚油酸的来源
• 1.2 共轭亚油酸的生理功能
• 1.2.1 共轭亚油酸异构体抗癌作用
• 1.2.2 共轭亚油酸异构体机体免疫作用
• 1.2.3 共轭亚油酸异构体抗氧化作用
• 1.2.4 共轭亚油酸异构体降脂减肥作用
• 1.2.5 共轭亚油酸异构体动脉粥样硬化作用
• 1.3 共轭亚油酸的制备方法
• 1.4 共轭亚油酸异构体分离方法的总结
• 1.5 动脉粥样硬化的发生发展及可能的治疗方法
• 1.6 项目目的和研究意义
• 2 共轭亚油酸两种主要异构体尿素包合法分离制备技术
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试剂和仪器设备
• 2.1.2 尿素包合共轭亚油酸实验过程
• 2.1.3 尿素中包合油脂的回收
• 2.1.4 回收尿素的再利用
• 2.1.5 尿素试纸的制备及尿素残留检测
• 2.1.6 脂肪酸组成分析测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 小试研究结果
• 2.2.2 中试研究结果
• 2.2.3 尿素中包合脂肪酸的回收
• 2.2.4 尿素的回收和重复利用
• 2.2.5 尿素残留检测
• 2.3 小结
• 3 共轭亚油酸两种主要异构体冷冻结晶分离制备技术
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 试剂和仪器设备
• 3.1.2 原料CLA中饱和脂肪酸的去除
• 3.1.3 冷冻分离
• 3.1.4 脂肪酸组成分析测定
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 原料CLA中饱和脂肪酸的去除共轭亚油酸与尿素比例的确定
• 3.2.2 冷冻分离小试
• 3.2.3 中试放大试验
• 3.3 小结
• 4 共轭亚油酸两种主要异构体酶法分离研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 试剂和仪器设备
• 4.1.2 酶法分离共轭亚油酸异构体
• 4.1.3 脂肪酸组成分析测定
• 4.1.4 酯化率的计算
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 反应中两种异构体在CLA乙酯和CLA脂肪酸中的比例随时间变化结果
• 4.2.2 反应酯化率、CLA乙酯和CLA脂肪酸中的CLA含量随时间变化结果
• 4.2.3 反应条件正交试验
• 4.2.4 中试反应实验
• 4.2.5 异构体分离
• 4.3 结论
• 5 无溶剂体系酶促酯化反应合成共轭亚油酸甘油三酯的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试剂和仪器设备
• 5.1.2 酶法酯化共轭亚油酸和甘油合成甘油三酯
• 5.1.3 比较三种不同的反应方法
• 5.1.4 脂肪酸组成采用气相色谱分析法
• 5.1.5 酯化率的计算
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 四种脂肪酶酯化反应比较
• 5.2.2 酶用量对酯化反应的影响
• 5.2.3 试验条件的正交设计
• 5.2.4 三种反应方式酶重复利用次数对酯化反应影响的研究
• 5.2.5 Novozym435脂肪酶对共轭亚油酸异构体的选择性
• 5.3 结论
• 6 共轭亚油酸对血管内皮细胞的保护作用
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料和仪器设备
• 6.1.2 内皮细胞的培养
• 6.1.3 细胞增殖 MTT法测定
• 6.1.4 细胞凋亡的检测
• 6.1.5 统计学处理
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 共轭亚油酸对VEC存活率的影响
• 6.2.2 CLA部分阻断PA的细胞毒性作用
• 6.2.3 CLA部分阻断SA的细胞毒性作用
• 6.3 小结
• 7 不同异构体比例共轭亚油酸抗动脉粥样硬化作用的研究
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 实验动物
• 7.1.2 药品与试剂
• 7.1.3 实验仪器
• 7.1.4 动脉硬化模型的建立
• 7.1.5 实验分组与给药方法
• 7.1.6 实验取材
• 7.1.7 生化指标测定
• 7.1.8 肉眼观察
• 7.1.9 光镜样品制备
• 7.2 结果与讨论
• 7.2.1 不同异构体比例共轭亚油酸对大鼠体重增加情况
• 7.2.2 不同异构体比例共轭亚油酸对大鼠动脉粥样硬化模型血脂的影响
• 7.2.3 对大鼠血浆MDA水平和SOD活性的影响
• 7.2.4 肉眼观察结果
• 7.2.5 光镜观察结果
• 7.3 小结
• 8 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文