酵母双杂交技术鉴定与拟南芥AtMT-A70B相互作用基因的研究

论文摘要

mRNA在线粒体内翻译成蛋白质。前体mRNA在进入线粒体之前必须经过一系列转录后修饰,这些修饰包括在5′端加上帽子结构,3′端加上多聚腺苷酸尾巴以及剪接修饰。除了这些常见的修饰外,对特定核苷酸的修饰也是经常发生的。RNA分子生物学研究表明RNA的转录后修饰在调控基因表达方面发挥着重要的作用。尤其是腺嘌呤上第六个氮原子的甲基化在mRNA的加工和运输过程中的研究越来越成为该方面研究的热点问题。负责拟南芥中腺嘌呤甲基化酶（AtMT-A70）的基因（MB*）已经被Rupert.G.Fray博士的实验小组分离出来,而且进一步的研究表明该基因对拟南芥种子胚胎发育有着致命的影响。 为了进一步寻找完成甲基化过程所需要的其他成员,本试验研究用RT-PCR和PCR技术对MB*进行了克隆,并用其作为探针在酵母双杂交系统下来扫描拟南芥花药cDNA基因文库。经过反复筛选证明,克隆B1/2,B1/14,B1/20,B13/1和B15/7与MB*有强烈的相互作用。进一步对这些克隆测序和Blast分析证明克隆B15/7,B1/14,B1/20表达的蛋白在拟南芥中的代号为At5g49020,但是功能未知;克隆B13/1,B1/2表达的蛋白在拟南芥中的代号是At3g61690,其功能为精氨酸-N-甲基转移酶;它们都参与甲基化过程,该发现尚属首次。本试验结果对进一步认识mRNA甲基化过程以及参与这一过程的相关蛋白具有重要的意义。在试验过程中用到了很多高级的生物学技术,比如说PCR,RT-PCR和酵母双杂交技术。

论文目录

• Abstract
• Abbreviations
• Chapter 1 Introduction
• 1.1 About the most common modification of adenosines in mRNA
• 1.2 About the MB*（AtMT-A70B）
• 1.3 About the gateway cloning technology
• 1.4 About the Yeast two Hybrid system
• 1.5 The ProQuest? Two-Hybrid System with Gateway? Technology
• 1.6 The procedure of the experiment
• Chapter 2 Material and methods
• 2.1 Growth of plant
• 2.2 RNA extraction
• 2.3 Preparation of agarose gels
• 2.4 RT-PCR（Reverse Transcription PCR）
• 2.5 QIaquick gel extraction kit protocol
• 2.6 Information of pENTR/D-TOPO vector
• 2.7 Put PCR products（MB*） into Entry vector use Gateway? Cloning Technology（BP Recombination reaction）
• 2.8 Preparation of competent host strain DH5a E. coli cells
• 2.9 Transformation of competent DH5a E. coli cells by MB* / pENTR
• 2.10 MB*/ pENTR plasmid DNA minipreps（QIAGEN）
• 2.11 Mediums for Yeast-two Hybrid screen
• 2.12 Plates for Yeast two Hybrid screen
• 2.13 Low-Copy-Number DB and AD Vectors （ARS/CEN）
• 2.14 Small-Scale Transformation of MaV203
• 2.15 Library scale transformation
• 2.16 Galactosidase filter assay
• 2.17 Assessing Self-Activation
• 2.18 Transfer MB* to pDESTTM 32 and two-hybrid screen
• 2.19 Yeast plasmid isolation
• Chapter 3 Cloning of MB*
• 3.1 Cloning of MB*
• 3.2 Construction of the bait plasmid
• 3.3 Sequence of MB*/ pENTR
• Chapter 4 Screening Arobidopsis cDNA library by MB* bait
• 4.1 Transfer MB* to pDEST32 using gateway technology
• 4.2 Test of the autoactivation of the MB*-bait
• 4.3 Library-scale transformation of yeast competent cell Mav203
• 4.4 Identification of positive clones
• 4.4.1 Growth assays
• 4.4.2 X-gal assays
• 4.4.3 Library plasmid isolation
• 4.4.4 Confirmation of positive clones
• 4.4.5 Sequence of the positive clones
• 4.4.6 Identification of positive clones （BLAST searches）
• Chapter 5 Discussion and future work
• Reference
• 摘要