论文摘要
肝癌是我国高发恶性肿瘤之一,特别是东南沿海地区为肝癌高发地带,其发病率居各种恶性肿瘤的第四位,死亡率居第一位。目前临床上有效治疗肝癌的方法只有手术切除,并且病人术后5年生存率低。通过分子生物学技术探讨肝癌发生发展的规律,将有助于寻找有效治疗肝癌药物的靶标。本室1998年克隆的新基因RTN4B,在正常肝组织中不表达但在肝癌组织中却异常高表达,提示该基因可能与肝癌的发生发展存在某种联系。肝脏是一个供血丰富的器官,肝癌细胞克隆化生长过程中常被结缔组织包膜所包裹,处于包膜内外的肝癌细胞和正常肝细胞的供血和供氧条件则然不同。近年有文献报道,RTN4B能够诱导血管内皮细胞的粘附和迁移,并且参与血管损伤后的重塑。依据这一提示,我们推测RTN4B在肝癌中的异常表达很可能与肝癌内的血管生长有关,如果能证实RTN4B可促进肝癌血管生成并参与肝癌的快速生长,那么RTN4B就将成为筛选有效治疗肝癌药物的一个重要靶点。为此,我们选择了RTN4B作为本文的研究对象。我们发现含有外源RTN4B的L02和QGY—7703的稳定表达细胞株,与稳定转染空载体的同源细胞株在生长速度上并无显著差异,但是当把含外源RTN4B的稳定细胞株接种于裸鼠腋部皮下之后,却令人惊奇地观察到RTN4B的稳定细胞株能够显著促进裸鼠皮下的肝癌瘤体的生长。长出的瘤体经组化检测,显示稳定表达外源RTN4B的瘤体内血管密度明显高于稳定转染空载体的瘤体内的血管密度。提示RTN4B在肝癌组织内特异表达的生物学意义可能是促进肿瘤组织内血管生成。通过细胞组化和FACS技术,我们发现RTN4B定位于细胞质膜上,还可分泌到胞外基质中。培养上清液的超离心沉淀物镜检结果提示分泌过程很可能是通过外排体（exosome）实现的。经对各种肝癌细胞株的培养上清和细胞裂解物进行免疫印迹分析,我们发现在所有的肝癌细胞株以及它们生长的培养基中均可检测到RTN4B蛋白。我们还观察到由酵母表达系统产生并经亲和纯化获得的RTN4B重组蛋白,在体外能够诱导人血管内皮细胞的粘附、迁移及伸展。运用血管生成研究中的经典实验:小鼠角膜模型及鸡尿囊膜模型,检测RTN4B对血管生成的作用,发现在动物模型水平上RTN4B具有诱导血管生成的作用。当用RNAi技术有效消减SMMC-7721细胞的RTN4B mRNA后,裸鼠皮下的肝癌细胞瘤体比野生型SMMC-7721肝癌细胞瘤体显著减小,组化结果显示血管密度也显著疏于野生型SMMC-7721细胞瘤体的血管密度,证明消减RTN4B可抑制肿瘤内血管生成进而抑制肿瘤的生长速度。我们进一步采用制作大鼠肝动脉结扎模型的方法,观察大鼠肝动脉结扎后,在低氧条件下正常肝内RTN4B的表达变化,结果发现RTN4B的表达能被低氧环境所诱导。综上所述,本项研究发现和证明在肝癌的发生发展过程中产生的低氧环境可诱导RTN4B大量表达,并分泌到细胞外促进肿瘤内血管的生成,进而加速肝癌瘤体的生长。消减肿瘤细胞内的RTN4B则可以抑制肿瘤内血管的生成进而抑制肿瘤的发展。RTN4B在肝癌内诱导血管生成的这一生物学特性,为我们筛选治疗肝癌的有效药物提供了一个重要的药靶,为设计新的肝癌治疗方法和策略提供了新的实验依据。