油菜花粉超微粉有效成分溶出、代谢特征及指纹图谱研究

论文摘要

油菜花粉是一种丰富的花粉资源,具有提高免疫活性、降血脂、抗肿瘤等生物学功能。目前对油菜花粉的研究侧重于基础和应用研究,而对于深入系统的研究较少。本研究以油菜花粉为实验材料,采用超微粉碎技术使花粉破壁,以普通粉碎方式作为对照,对比了两种粉碎方式对所得的超微粉和细粉中主要营养成分、有效成分的影响,及组织形态学上的差异;比较油菜花粉超微粉、细粉中槲皮素和山奈酚在实验动物体内的药代动力学参数;对油菜花粉超微粉多糖进行分级,筛选抗氧化和免疫活性部位,对活性部位多糖进行结构表征;建立油菜花粉超微粉黄酮类成分的HPLC指纹图谱,使这一丰富资源的开发和应用提高到新的水平,主要结果如下:1.分析比较了超微粉碎和普通粉碎方式对油菜花粉主要营养成分含量的影响,并比较了扫描电镜下超微粉和细粉形态学上的差异。结果表明:除粗纤维含量降低外,粗蛋白、粗脂肪、灰分、还原糖和总黄酮含量都有不同程度的提高。在电镜下观察,油菜花粉细粉基本可以看到完整的细胞形态,而超微粉的颗粒变小、大小均匀,绝大多数细胞壁破裂,基本无完整的细胞存在,破壁率为98.86%2.分别采用高效液相色谱法、比色法分析比较了油菜花粉超微粉和细粉中黄酮类成分（槲皮素、山奈酚）、不同浸提时间下多糖的溶出差异。结果表明:在相同的提取条件下,油菜花粉超微粉中槲皮素和山奈酚的溶出率比细粉分别提高了45.16%和27.86%。油菜花粉超微粉多糖的溶出量和溶出速度都大于细粉,浸提时间为10min时多糖的溶出率较细粉提高了252.54%;红外光谱结果显示油菜花粉超微粉和细粉多糖的主要基团无明显差异。超微粉碎可显著提高油菜花粉有效成分的溶出率。3.采用高效液相色谱法测定家兔灌胃给予油菜花粉超微粉和细粉后血浆中槲皮素和山奈酚的浓度,血药浓度-时间数据经药代动力学分析软件（PKS软件）处理,比较油菜花粉超微粉和细粉中槲皮素和山奈酚在家兔体内的药代动力学参数。结果表明:油菜花粉超微粉和细粉中槲皮素和山奈酚的药代动力学最佳模型均为二室开放模型。油菜花粉超微粉槲皮素的主要药动学参数:Ka=0.5793h-1, t1/2α=2.43h,t1/2β=18.33h,AUC0→∞=0.3613μg·L-1·h,Vd =804.8 L·kg-1,Tpeak =2.5714h,Cmax=0.01908μg·mL-1;油菜花粉细粉槲皮素的主要药动学参数:Ka=1.2790h-1,t1/2α=2.63 h,t1/2β= 28.00h,AUC0→∞= 0.3411μg·L-1·h,Vd = 997.3 L·kg-1,Tpeak =3.048 h , Cmax =0.018769μg·mL-1。油菜花粉超微粉山奈酚的主要药动学参数: Ka=0.4136h-1, t1/2α=2.29h,t1/2β=2.97h,AUC0→∞=1.8897μg·L-1·h,Vd =33.056L·kg-1,Tpeak =3.6429h,Cmax=0.28079μg·mL-1;油菜花粉细粉山奈酚的主要药动学参数:Ka=0.44362h-1 , t1/2α=1.74 h,t1/2β= 1.99h,AUC0→∞=1.4599μg·L-1·h,Vd = 31.418 L·kg-1,Tpeak =3.7143 h,Cmax =0.24553μg·mL-1。与细粉组比较,油菜花粉超微粉组血浆槲皮素和山奈酚的达峰时间缩短、达峰浓度提高,相对生物利用度较细粉分别提高了46.00%、29.44%。超微粉碎技术可提高油菜花粉有效成分槲皮素和山奈酚的生物利用度。4.采用不同截留分子量（100kD、50kD和10kD）的超滤膜对油菜花粉超微粉粗多糖进行分级纯化,分析了压力和时间对超滤过程的影响,确定最适操作条件,3种截留分子量的超滤膜运行时间分别控制在28、36和48min以内,操作压力分别为1.1、1.3和1.6MPa。油菜花粉超微粉粗多糖M按分子量分成M1>100kD、50kD<M2<100kD、10kD<M3<50kD及M4<10kD 4个级别,所得多糖质量分布比例约为2.3∶1∶1.1∶1.6,并获得各段分子量的多糖制品纯度均高于68%。通过体外抗氧化、体内抗氧化和免疫活性试验相结合对分级的产物跟踪筛选活性组分。体外清除（·OH）和（O2-·）的试验结果表明,油菜花粉多糖的抗氧化活性与其分子量分布密切相关,M3、M4两个级分的抗氧化作用较低,在后续试验中合并作为一个组分M3进行研究。由体内抗氧化、免疫活性试验筛选得到高活性组分M2和低活性组分M3,M2级分多糖较其它组分有较好的抗氧化和免疫活性,各组分的抗氧化和免疫活性大小顺序为M2>M>M1>M3。5. M2级分多糖先后经DEAE- SephadexA -25离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析纯化得到RPP1-2。经高效液相凝胶色谱鉴定其纯度及计算分子量,RPP1-2为单一对称峰,重均分子量为65358Da。离子色谱测定RPP1-2中-SO42-含量为2.81%。紫外光谱、红外光谱和核磁共振分析结果表明,RPP1-2为糖蛋白缀合物,为α-糖苷键构型,分子结构中存在α-（1,3）、α-（1,6）糖苷键,RPP1-2由3种不同单糖残基组成的杂多糖,糖链中重复单位包含葡萄糖、甘露糖和半乳糖。6.采用高效液相色谱法对不同产地的油菜花粉超微粉的指纹图谱进行比较,应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件对油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC指纹图谱进行分析评价。以芦丁为内标物,采用Diamonsil C18柱（250×4.6 mm,5μm）为分析色谱柱,乙腈-0.4%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速0.8 mL·min-1,检测波长254 nm,柱温25℃。结果表明: 10批不同产地的油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC指纹图谱较相似,各成分得到较好的分离,并根据检测结果确定了10个共有指纹峰。该方法具有重现性好,特征性强,方法简便、快速等特点,能够客观反映油菜花粉超微粉的指纹特征,可以成为油菜花粉超微粉质量评价及控制的表征指标。

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中文摘要

Abstract

第一章文献综述

1 油菜花粉的研究概况

1.1 油菜花粉破壁研究

1.2 油菜花粉多糖研究进展

1.3 油菜花粉黄酮类成分研究进展

1.4 油菜花粉的药理作用

1.4.1 降血脂作用

1.4.2 抗肿瘤作用

1.4.3 抑制前列腺增生

1.4.4 增强机体免疫功能作用

1.4.5 抗氧化作用

1.4.6 其它作用

1.5 花粉在食品加工中的应用

1.6 花粉在动物生产中的应用

2 超微粉碎技术在食品工业中应用研究进展

2.1 超微粉碎技术的概念

2.2 超微粉碎技术的特点和分类

2.3 超微粉碎技术在食品工业中的应用

2.3.1 果蔬类食品加工

2.3.2 粮食加工

2.3.3 肉类加工

2.3.4 水产品加工

2.3.5 调味品加工

2.3.6 超微粉碎技术在其它食品加工中的应用

3 黄酮类化合物药代动力学研究概况

3.1 生物样品分析

3.1.1 生物样品前处理

3.1.2 主要的检测技术

3.2 黄酮类化合物的药动学研究

4 指纹图谱研究概况

4.1 指纹图谱的定义

4.2 指纹图谱的特点和作用

4.3 指纹图谱主要研究技术

4.3.1 薄层色潜法（TIC）

4.3.2 高效液相色谱法（HPLC）

4.3.3 气相色谱法（GC）

4.3.4 高效毛细管电泳法（HPCE）

4.3.5 联用技术

4.4 指纹图谱的研究现状

4.5 指纹图谱在食品工业中的应用现状

5 本论文的立题依据、研究内容及研究意义

第二章油菜花粉超微粉主要成分分析及组织形态学研究

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

2 实验方法

2.1 破壁率的检测

2.2 主要成分分析

2.2.1 粗蛋白含量测定

2.2.2 粗脂肪测定

2.2.3 灰分测定

2.2.4 粗纤维含量测定

2.2.5 还原糖测定

2.2.6 总黄酮含量测定

2.3 组织形态学研究

2.3.1 粉末全貌和粉末细胞特征扫描电子显微镜观察

2.3.2 松密度测定

2.3.3 比表面积测定

2.3.4 粒径测定

3 结果与分析

3.1 油菜花粉超微粉和细粉主要营养成分分析

3.2 总黄酮含量测定结果

3.3 油菜花粉超微粉和细粉组织形态学研究

3.3.1 粉末全貌特征扫描电子显微镜观察

3.3.2 粉末细胞特征扫描电子显微镜观察

3.3.3 松密度、比表面积和粒径测定结果

4 讨论与结论

第三章油菜花粉超微粉和细粉中功能性成分——多糖和黄酮类物质的溶出研究

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

2 实验方法

2.1 油菜花粉超微粉和细粉多糖的溶出研究

2.1.1 油菜花粉超微粉和细粉粗多糖的提取

2.1.2 油菜花粉超微粉和细粉粗多糖中多糖的含量

2.1.3 红外光谱分析

2.2 油菜花粉超微粉和细粉黄酮类物质的溶出研究

2.2.1 色谱条件

2.2.2 对照品溶液的制备

2.2.3 供试品溶液的制备

2.2.4 标准曲线的制备

2.2.5 方法学考察

2.2.6 样品测定

3 结果与分析

3.1 油菜花粉超微粉和细粉多糖溶出结果

3.1.1 油菜花粉超微粉和细粉粗多糖的提取率

3.1.2 葡萄糖标准曲线和多糖的百分含量

3.1.3 油菜花粉超微粉和细粉多糖的溶出率

3.1.4 红外光谱分析

3.2 油菜花粉超微粉和细粉黄酮类物质的溶出结果

3.2.1 系统适应性

3.2.2 槲皮素和山奈酚对照品标准曲线

3.2.3 精密度试验结果

3.2.4 稳定性试验结果

3.2.5 回收率试验结果

3.2.6 样品含量测定结果

4 讨论与结论

第四章油菜花粉有效成分槲皮素和山奈酚在家兔体内的药代动力学研究

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 药品与试剂

1.3 主要仪器

1.4 试验动物

2 实验方法

2.1 给药方案

2.2 兔血浆中槲皮素和山奈酚含量测定方法的建立

2.2.1 色谱条件

2.2.2 血浆样品预处理

2.2.3 标准曲线和线性范围

2.2.4 精密度和回收率试验

2.2.5 稳定性试验

2.2.6 数据处理

3 结果与分析

3.1 血浆中槲皮素、山奈酚测定方法的建立

3.2 标准曲线和线性范围

3.3 精密度和回收率试验结果

3.4 稳定性试验结果

3.5 家兔灌胃给予油菜花粉后两组试验动物的平均药物浓度

3.6 家兔灌胃给予油菜花粉后槲皮素和山奈酚的药代动力学参数

4 讨论与结论

第五章油菜花粉超微粉多糖分级分离、结构鉴定及抗氧化、免疫活性研究

1 油菜花粉超微粉多糖分级分离及抗氧化、免疫活性研究

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器

1.1.4 试验动物

1.2 实验方法

1.2.1 超滤膜分离油菜花粉超微粉多糖的研究

1.2.2 油菜花粉超微粉多糖各组分的体外抗氧化作用

1.2.3 油菜花粉超微粉多糖各组分体内抗氧化作用

1.2.4 油菜花粉超微粉多糖各组分对小鼠免疫功能的影响

1.3 结果与分析

1.3.1 超滤膜分离油菜花粉超微粉多糖的研究

1.3.2 油菜花粉超微粉多糖各组分的体外抗氧化作用结果

1.3.3 油菜花粉超微粉多糖各组分的体内抗氧化作用结果

1.3.4 油菜花粉超微粉多糖各组分的免疫活性作用结果

1.4 讨论与结论

2 油菜花粉超微粉多糖活性级分的结构表征

2.1 材料与仪器

2.1.1 材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 活性级分多糖的分离纯化

2.2.2 多糖纯度鉴定及分子量测定

2.2.3 光谱学分析

2.2.4 硫酸根含量的测定

2.2.5 核磁共振

2.3 结果与分析

2.3.1 50kD-100kD 多糖级分的分离纯化

2.3.2 多糖的纯度鉴定及分子量测定结果

2.3.3 油菜花粉多糖RPP1-2 的理化性质

2.3.4 油菜花粉多糖RPP1-2 光谱学性质

2.3.5 油菜花粉多糖RPP1-2 硫酸根含量测定结果

2.3.6 油菜花粉多糖RPP1-2 的核磁共振分析

2.4 讨论与结论

第六章油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC 指纹图谱的研究

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 实验方法

2.1 色谱条件

2.2 内标溶液和供试品溶液的制备

2.3 比较超声和回流方式对黄酮类成分的提取效果

2.4 比较不同溶剂对黄酮类成分的提取效果

2.5 正交优选油菜花粉超微粉黄酮类成分提取工艺

2.6 方法学考察

2.6.1 仪器精密度考察

2.6.2 样品的稳定性考察

2.6.3 方法重现性考察

2.7 不同产地油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC 指纹图谱的建立

2.8 相似度评价

3 结果与分析

3.1 超声和回流方式对黄酮类成分的提取结果

3.2 不同溶剂对黄酮类成分的提取结果

3.3 正交优选油菜花粉超微粉黄酮类成分提取工艺试验结果

3.4 方法学考察结果

3.4.1 仪器精密度考察

3.4.2 样品的稳定性考察

3.4.3 方法重现性考察

3.5 不同产地油菜花粉超微粉样品的指纹图谱

3.6 共有指纹峰的标定

3.7 油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC 指纹图谱的建立

3.8 相似度评价结果

4 讨论与结论

4.1 提取溶剂的考察

4.2 色谱条件的选择

4.2.1 流动相和梯度洗脱程序的建立

4.2.2 色谱柱的选择

4.2.3 检测波长的选择

4.3 内标的选定

4.4 相似度评价

4.5 结论

第七章全文总结

1 本研究结论

2 本研究创新点

3 本研究还需进一步解决的问题

参考文献

致谢

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