跨膜接头蛋白Cbp在受体型酪氨酸激酶相关信号转导和细胞活动中的功能研究

论文摘要

生长因子（growth factor）刺激哺乳动物细胞后引起细胞生长、分化、迁移等变化。生长因子本身不能穿透细胞膜,它们通过结合并且改变跨膜形式的酪氨酸蛋白激酶（即受体型酪氨酸激酶）的活性向细胞内传递信号。受体型酪氨酸激酶激活某些下游信号通路时需要非受体型酪氨酸激酶Src的帮助。Src及其同源家族激酶主要定位在细胞内膜,然而其最重要的负调控因子之一的Csk（C-terminus Src kinase）则主要定位于胞浆。曾有一段时间人们对Csk如何调控Src的机制非常迷惑。在2000年,科学家首次报道了跨膜蛋白Cbp（Csk-bindingprotein）可以将Csk从胞浆招募到细胞膜,并且过量表达Cbp可以引起Src活力降低（Kawabuchi et al., 2000;Tomas Brdicka et al., 2000）。不仅如此,科学家还进一步证实了Cbp和Csk的结合对于维持静息状态下T细胞中Src家族激酶的低活力状态非常重要（TomasBrdicka et al., 2000）。在这样的基础上我们提出:Cbp有可能通过Csk和Src调节生长因子受体介导的信号转导。生化实验的结果表明,Cbp的确可以抑制EGF（表皮生长因子）诱导的Src, MAPK（mitogen-activated protein kinase）,以及PKB/Akt（protein kinase B/Akt）蛋白激酶的活化。然而,几乎同样的实验结果被同行抢先发表（Matsuoka et al., 2004）。于是我们在细胞水平做了一些深入研究。实验表明Cbp可以通过Csk和Src抑制EGF诱导的成纤维细胞向肿瘤样细胞的转化以及肿瘤细胞在软琼脂中的生长。综上所述,本工作的主要贡献在于首次给出了一些支持Cbp抑制肿瘤发生和生长的细胞生物学证据。此外我们在Cbp调节FGFR（成纤维细胞生长因子受体）的功能等方面也得到了一些初步的新的实验结果。

论文目录

• 摘要
• 关键字
• ABSTRACT
• KEYWORD
• 1 前言
• 1.1 受体型酪氨酸激酶的一般特征
• 1.2 表皮生长因子受体
• 1.2.1 结构特征
• 1.2.2 配基依赖的受体激活
• 1.2.3 非配基依赖的受体激活
• 1.2.4 MAPK 信号通路
• 3K/Akt 信号通路'>1.2.5 PI₃K/Akt 信号通路
• 1.2.6 受体内吞与降解
• 1.2.7 其他的负向调节机制
• 1.2.8 表皮生长因子受体与肿瘤的关系
• 1.3 SRC 家族激酶
• 1.3.1 结构特征和调节方式
• 1.3.2 Src 与表皮生长因子受体的相互作用
• 1.4 CSK 和CBP 的背景介绍
• 1.4.1 Csk 的基本结构与功能
• 1.4.2 Cbp 的结构特征
• 1.4.3 Cbp 的基本功能
• 1.4.4 其他跨膜接头蛋白
• 1.5 脂膜微区
• 1.5.1 胞膜窖
• 1.5.2 最初的脂膜微区假说
• 1.5.3 脂膜微区的功能
• 1.5.4 脂膜微区概念的更新
• 1.6 P120CTN
• 1.6.1 犰狳（armadillo）蛋白
• 1.6.2 p120ctn 的基因及蛋白质一级结构特征
• 1.6.3 p120ctn 的功能
• 2 课题立意和实验工作的框架结构
• 3 实验材料
• 4 实验方法
• 4.1 分子克隆
• 4.1.1 质粒的小量制备
• 4.1.2 PCR
• 4.1.3 DNA 的酶切
• 4.1.4 DNA 5’端去磷酸化
• 4.1.5 DNA 琼脂糖凝胶电泳
• 4.1.6 DNA 片断的连接
• 4.2 融合蛋白的表达与纯化
• 4.2.1 感受态细菌制备
• 4.2.2 质粒DNA 转化细菌
• 4.2.3 GST 融合蛋白的表达与纯化
• 4.2.4 6-His 融合蛋白的表达与纯化
• 4.3 细胞生物学操作
• 4.3.1 通常培养
• 4.3.2 磷酸钙转染方法
• 4.3.3 细胞因子刺激
• 4.3.4 建立稳定表达细胞株
• 4.3.5 反转录病毒的制备和细胞转化实验
• 4.3.6 软琼脂集落形成实验
• 4.4 生物化学操作
• 4.4.1 免疫沉淀
• 4.4.2 免疫印迹（Western-Blot）
• 4.4.3 蛋白质的定量
• 4.4.4 体外结合（PullDown Assay）
• 4.4.5 考马斯染色
• 4.4.6 嗜银染色
• 4.5 抗体的制备和纯化
• 4.5.1 大白兔和小鼠的免疫
• 4.5.2 杂交瘤细胞与脾细胞的融合及筛选
• 4.5.3 亲合纯化
• 5 实验结果
• 5.1 检测细胞内源性的CBP 蛋白
• 5.2 CBP 抑制EGF 诱导的信号转导
• 5.2.1 EGFR 高表达引起Cbp 酪氨酸磷酸化增加
• 5.2.2 EGF 诱导的Cbp 酪氨酸磷酸化以及与Csk 的结合
• 5.2.3 EGF 通过SFK 诱导Cbp 酪氨酸磷酸化
• 5.2.4 Cbp 的Tyr317 位点介导了Cbp 与Csk 的结合
• 5.2.5 Cbp 抑制EGF 诱导的Src,ERK1/2 和 Akt-1 激活
• 5.3 CBP 调节EGF 诱导的信号转化以及其他细胞活动
• 5.3.1 Cbp-Csk 复合物调节EGF 诱导的细胞转化
• 5.3.2 Cbp 影响细胞迁移
• 5.3.3 Cbp-Csk 复合物抑制肿瘤细胞在软琼脂中的生长
• 5.3.4 裸鼠体内成瘤实验
• 5.4 CBP 与受体型酪氨酸激酶的其他相互作用
• 5.4.1 Cbp 高表达抑制EGFR 的酪氨酸磷酸化
• 5.4.2 多种受体型酪氨酸激酶的过表达均引起Cbp 的磷酸化
• 5.4.3 Cbp 结合FGFR1 并改变其表观分子量
• 5.4.4 各种Cbp 突变体和FGFR1 的相互作用
• 5.4.5 Cbp 和FR52 在NIH3T3 细胞中的共定位
• 5.4.6 Cbp 和Insulin 受体结合
• 5.5 CBP 和脂膜微区的相互作用
• 5.5.1 Cbp, EGFR, Src 和部分Csk 都定位于脂膜微区
• 5.5.2 Cbp 和caveolin-1 的结合
• 5.5.3 胆固醇萃取试剂处理细胞对Cbp 酪氨酸磷酸化的影响
• 5.5.4 Cbp 可能是脂膜微区中主要的Csk 结合蛋白
• 5.6 新的CSK 结合蛋白
• 5.6.1 体外结合实验
• 5.6.2 得到p120ctn 的基因
• 5.6.3 Csk 结合p120ctn 的体内验证
• 5.7 合作课题
• 5.7.1 白介素4 激活CTL44 细胞的STAT6
• 6 讨论
• 6.1 CBP 调节EGF 信号转导的分子机制
• 6.2 CBP 调节细胞转化和生长的分子机制
• 6.3 CBP 调节FGFR 相关的信号转导
• 6.4 CBP 和脂膜微区的关系
• 7 结论
• 8 致谢
• 参考文献
• 附录
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