人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞

论文摘要

目的:探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hBMSCs）定向诱导分化为心肌样细胞的实验条件。方法:取成人弃骨骨髓,通过全骨髓贴壁法分离培养hBMSCs。在传至第三代时,筛选具有心肌特异性分化潜能的c-kit+的hBMSCs细胞克隆,用含20%胎牛血清的低糖DMEM培养液继续克隆培养。当细胞达到70%融合时,分别用10μmol/l5-氮胞苷（5-azacytidine crystalline,5-aza）,100mg/l参麦注射液,10μmol/l5-氮胞苷和100mg/l参麦注射液3组诱导剂诱导hBMSCs。24小时后,更换为含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液继续培养。在诱导3周后,通过显微镜下观察其形态变化。用免疫细胞化学方法检测心肌特异性标记抗原Desmin和肌钙蛋白T的表达;用RT-PCR方法检测心肌特异基因心房利尿肽（atrial natriuretic peptide,ANP）和脑钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）表达。结果:骨髓中含有多种hBMSCs细胞克隆,其中成纤维细胞样克隆表达c-kit+。分别用3组诱导剂诱导c-kit+细胞15天后,部分细胞胞体明显增粗,可见有些细胞间有融合样现象发生。诱导3周后,3组都有类似肌管样细胞出现,细胞短粗,呈不规则的圆柱形,有分支,互相连成网。苏木精-伊红（hematoxylin-eosin HE）染色后,3组细胞都排列规则,类似于心肌细胞的形态,可见部分细胞有排列规则的横纹样结构。免疫细胞化学显示诱导3周后的hBMSCs,Desmin阳性细胞数目分别是:5-aza组（65.3±4.7%）,参麦注射液组（62.3±3.9%）,5-aza和参麦注射液组（68.5±2.1%）,3组Desmin阳性细胞表达率无显著差异; cTnT阳性细胞数目分别是:5-aza组（62.2±4.1%）,参麦注射液组（63.8±3.4%）, 5-aza和参麦注射液组（66.0±6.2%）,3组Desmin阳性细胞表达率无显著差异。阴性对照组和未分化的hBMSCs均无Desmin和cTnT的表达。RT-PCR显示3种不同的诱导剂诱导hBMSCs3周后都有ANP,BNP的表达,未分化的hBMSCs无ANP,BNP的表达。结论:5-aza和中药可以诱导c-kit+的hBMSCs细胞克隆分化为心肌样细胞。体外诱导成的心肌样细胞表现为未成熟心肌细胞的结构和功能特征。证明骨髓中含有多种干细胞克隆,c-kit可作为筛选hBMSCs向心肌样细胞分化的一项检测指标。筛选具有心肌特异性分化潜能的hMSCs可提高诱导分化率。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 人骨髓间充质干细胞的收集与处理
• 1.2 主要试剂与配制方法
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 实验耗材
• 2 方法
• 2.1 人骨髓间充质干细胞的培养
• 2.2 人骨髓间充质干细胞的克隆培养
• +的人骨髓间充质干细胞克隆分选培养及间接免疫荧光染色'>2.3 c-kit⁺的人骨髓间充质干细胞克隆分选培养及间接免疫荧光染色
• +的人骨髓间充质干细胞克隆向心肌样细胞诱导分化'>2.4 c-kit⁺的人骨髓间充质干细胞克隆向心肌样细胞诱导分化
• 2.5 诱导后人骨髓间充质干细胞苏木精-伊红染色
• 2.6 免疫细胞化学技术检测诱导后人骨髓间充质干细胞Desmin 和cTnT 表达
• 2.7 诱导后人骨髓间充质干细胞c-kit 间接免疫荧光染色
• 2.8 诱导后人骨髓间充质干细胞RT-PCR 检测ANP 和BNP 的表达
• 结果
• 1 人骨髓间充质干细胞的形态
• +克隆的分选'>2 人骨髓间充质干细胞的克隆培养和c-kit⁺克隆的分选
• 3 诱导后人骨髓间充质干细胞的形态变化
• 4 诱导后人骨髓间充质干细胞c-kit 的表达
• 5 诱导后人骨髓间充质干细胞心肌肌钙蛋白T 和Desmin 的表达
• 6 诱导后人骨髓间充质干细胞心房利尿肽和脑钠肽的表达
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 作者简历
• 致谢
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