论文摘要
目的：研究针对内皮素受体A（ETRA）的质粒载体介导的小干扰核糖核酸（siRNA）对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用,并对其机制进行初步探索。方法：（1）设计针对内皮素受体A的siRNA两个序列,并构建带GFP（绿色荧光蛋白）基因的质粒载体。应用A10（大鼠血管平滑肌细胞）细胞系进行脂质体包裹的质粒转染。共分为4组：siRNA序列一组（siRNA#1组）：siRNA序列二（siRNA#2组）；空质粒载体组（Vector组）；单纯脂质体组（Lipo组）。通过荧光显微镜观察GFP检验质粒的转染效率,通过实时定量PCR检测ETRA mRNA水平,筛选沉默效率较高的siRNA序列。（2）雄性SD大鼠28只,随机分为4组：PBS假手术组（Sham组）,ETRA siRNA缺血组（siRNA组）,空载体缺血组（Vector组）,PBS缺血组（PBS组）。缺血组建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,夹闭左肾动脉1小时,开放左肾动脉时切除右肾。造模前48小时经左肾静脉逆行高压注射1ml的100ug／ml质粒PBS溶液或1mlPBS。造模后24小时收集左肾、下腔静脉血。检测血肌酐、尿素氮；肾组织提取RNA,行实时定量PCR检测ETRA mRNA,ET-1mRNA, TNF-αmRNA, IL-6 mRNA、MIP-2 mRNA、MCP-1 mRNA水平；肾组织提取蛋白,行western blotting检测ETRA蛋白水平；肾脏组织冰冻病理切片,观察肾组织局部GFP的表达以验证转染效率；肾脏组织病理切片常规HE染色,观察组织结构,并进行组织损伤半定量评分。并运用统计学分析比较各组间的差异。结果：（1）细胞实验：载体质粒组相对单纯脂质体组,在荧光显微镜下有明显的GFP表达。siRNA#1组相对siRNA#2组转染效率较高（P<0.05）。（2）动物实验：质粒给药组（siRNA、Vector组）肾脏冰冻病理切片荧光显微镜观察,和PBS给药组（PBS、Sham组）相比有明显的GFP表达。肾组织ETRA mRNA及ETRA蛋白水平,siRNA组均低于Vector、PBS组（P<0.05）。血肌酐、尿素氮水平,siRNA组均低于Vector、PBS组（P<0.05）。肾脏常规病理显示siRNA组在小管上皮细胞坏死、空泡化,小管管型方面较Vector、PBS组明显减轻,肾脏组织结构损伤半定量评分显示siRNA组较Vector、PBS明显减轻（P<0.05）。肾组织ET-1mRNA、TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、MIP-2 mRNA、MCP-1 mRNA表达显示,siRNA组均低于Vector、PBS组（P<0.05）。结论：（1）构建的质粒载体经脂质体包裹可成功转染进A10细胞内,ETRA siRNA序列一较序列二有更高的沉默效率。（2）经肾静脉逆行高压注射,质粒可成功转染至肾脏局部组织。（3）ETRA siRNA可有效抑制肾脏局部ETRA的表达,并可改善肾功能,减轻肾脏组织结构损伤。（4）ETRA siRNA可有效下调缺血再灌注损伤后肾脏局部的ET-1 mRNA,炎症因子TNF-αmRNA、IL-6 mRNA以及趋化因子TNF-αmRNA、IL-6 mRNA的水平。
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相关论文文献
- [1].血管内皮生长因子-A siRNA对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响及机制[J]. 中国老年学杂志 2016(03)