论文摘要
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）)是目前研究最深入、应用最广泛的微生物杀虫剂之一。但是现在广泛使用的Bt菌株普遍存在杀虫谱窄、作用效果缓慢等问题,因此深入发掘我国丰富的微生物资源,筛选高效广谱的特异性菌株,对于杀虫微生物的推广和使用、构建高效广谱的工程微生物和培育转基因抗虫植物都具有重要的理论和实践意义。 本研究从河北、山东、黑龙江、陕西等省份采集到的300份土壤中分离到苏云金芽孢杆菌菌株23株,平均分出率近8%。以甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hubner）、棉铃虫（Helicoverpa armigera Hubner）、粘虫（Mythimna separata Walker）的二龄幼虫为供试虫进行室内生物活性测定。从所有具有活性的菌株中得到了两株高毒力菌株:FY-2和LL-6,其中FY-2的毒力最高,对甜菜夜蛾和棉铃虫LC50值分别是3.3×106和1.8×106。 两个高毒力的菌株LL-6和FY-2与HD-1的SDS-PAGE电泳条带一致,主要的是130KD和60KD两个条带,但杀虫毒力有所不同,FY-2菌株的杀虫活性明显高于HD-1。 以GT液体培养基连续24小时发酵培养,以HD-1为标准菌株,测量FY-2和LL-6的生长曲线,发现其生长的差异性不显著,在实际生产和应用中无需作特殊处理。 采用宋福平博士建立的PCR-RFLP体系对FY-2菌株的鉴定发现,其含有cry2Ac类基因。利用重新设计的引物FY2A5和FY2A3,加入了EcoRI和BamHI内切酶识别位点,对该菌株cry2Ac的全序列克隆和测序发现,该序列与cry2Ac1、cry2Ac2、cry2Ac3的同源性处于95%和99%之间,为一种新的cry2Ac类基因。该基因全序列的长度为1872bp,编码633个氨基酸,是一种弱碱性氨基酸。目前已经在NCBI GENEBANK中登记,登记号是DQ020578。利用表达载体pET-21b成功的使该基因在大肠杆菌BL-21中获得表达,但表达蛋白的毒力有了明显的下降,只对供试的棉铃虫有较强的体重抑制率。