缓激肽受体在脑缺血再灌流中的作用研究

论文摘要

缺血性脑卒中是引起人类非自然死亡和致残的主要疾病之一。激肽释放酶—激肽系统（kallikrein—kinin system，KKS）作为公认的炎症调节系统在缺血性脑血管病的病理过程中发挥重要作用。近年来研究提示，这一系统可能在脑缺血后的不同时期发挥截然不同的作用，并且可通过其终末效应物质缓激肽，作用于缓激肽B1和B2受体，对脑缺血后的细胞凋亡产生影响。本研究观察KKS各组分在脑缺血后的动态表达变化及缓激肽受体在缺血组织中的细胞分布，进一步应用缓激肽受体的特异性抑制剂对脑缺血动物进行干预，探讨KKS在脑缺血后不同时期的作用及其深层机制。为排除复杂内环境的影响，本研究采用缺糖、缺氧（oxygen-glucose deprivation，OGD）后复糖、复氧的神经元模型，应用缓激肽受体的特异性激动剂和抑制剂对其进行干预，以验证缓激肽受体在神经元凋亡中的作用。我们拟通过本研究明确KKS在脑缺血后发挥不同作用的病理基础，以期为缺血性脑卒中提供新的治疗靶点。第一部分：激肽释放酶—激肽系统在脑缺血后的动态表达研究缺血后KKS各组分的动态表达变化，是探索KKS在脑缺血后不同时期作用的理论前提。本部分制作大鼠左侧大脑中动脉梗塞模型，缺血90min后恢复再灌流。观察实验性脑缺血再灌注损伤后不同时期组织型激肽释放酶（tissuekallikrein，TK）活性、缓激肽（bradykinin，BK）含量、缓激肽B1受体（B1 receptor，B1R）和B2受体（B2 receptor，B2R）的动态表达及细胞分布。取左侧前囟前、后1mm（相当于缺血核心区）脑组织，通过生物酶学方法测定脑组织TK活性、运用ELISA技术测定脑组织BK浓度，测定时间点为：缺血前和再灌流后2h、4h、6h、12h、24h和48h；采用RT—PCR及western-blot技术，测定缓激肽B1R和B2R的mRNA及蛋白表达水平，测定时间点为：缺血再灌流后3h、6h、12h、24h、48h、72h、4d及7d；根据Western—blot结果，分别在缓激肽B1R和B2R的表达高峰时间点，即再灌流后12h和72h，采用免疫荧光双标技术，观察缺血后缓激肽B1R和B2R在神经元和星型胶质细胞的分布情况。结果：1、缺血后脑组织TK活性明显增高，于再灌流后2h到达高峰；缺血后脑组织BK浓度显著增高，也在再灌流后2h达到高峰；两者变化趋势一致。2、缺血后脑组织缓激肽B1R的mRNA和蛋白水平迅速上调，于再灌流后12h到达高峰，而后迅速下降，再灌流后第4d回到基线水平；而缓激肽B2R的mRNA和蛋白水平在脑缺血后上调缓慢，于再灌流48～72h到达高峰，之后缓慢下调，再灌流后第7d仍高于基线水平。3、缺血后缓激肽B1R主要分布于反应增生的星形胶质细胞；而缓激肽B2R主要分布于缺血周边区的皮层神经元。研究提示：缓激肽B1R和B2R在缺血再灌流后的动态表达和细胞分布存在很大差异，这可能是导致KKS在脑缺血不同时期发挥不同作用的病理基础。第二部分：缓激肽受体在脑缺血后不同时期的作用研究本研究观察到：缺血后脑组织内缓激肽B1R和B2R在时间动态变化和细胞分布方面存在很大差异。为进一步探讨KKS在脑缺血中的作用，我们分别应用缓激肽B1R的特异性抑制剂Lys-（des-Arg9-Leu8）-BK和B2R的特异性抑制剂bradyzide，对脑缺血动物进行干预，以深入了解这两个受体对缺血后组织损伤的影响。仍采用上述大鼠左侧大脑中动脉梗塞模型，缺血90min后恢复再灌流。脑缺血模型分为即刻干预和24h后干预两大组。即刻干预指在缺血再灌流后即刻尾静脉给药，再灌流24h处死动物；而24h后干预是指在缺血再灌流后24h方开始尾静脉给药，每日一次，7d后处死动物；每大组动物根据干预方式不同，又随机分为四组：假手术组、生理盐水干预组（生理盐水2ml／kg）、B1R抑制剂组（300μg／kg）和B2R抑制剂组（0.75 nmol／kg）。测定指标包括：神经功能评分（NSS）、梗死体积（TTC染色）、血脑屏障通透性（伊文氏蓝染色）、超微结构（电镜）、炎症因子分泌（ELISA）、细胞凋亡（TUNEL）以及B1R和B2R受体的表达（westem-blot）。结果：1、即刻干预组动物，缓激肽B1R和B2R的抑制剂均能显著改善脑缺血导致的神经功能障碍、减小梗死体积、降低血脑屏障通透性、改善超微结构损伤、抑制炎症因子的释放、减少细胞凋亡；上述作用，B2R抑制剂均优于B1R抑制剂。2、24h后干预组动物，两种抑制剂作用显著不同，B1R抑制剂能够抑制缺血后细胞凋亡、减小梗死体积、改善神经功能；而B2R抑制剂能够增加缺血区细胞凋亡、增大梗死体积、加重缺血后神经损伤。3、缓激肽两受体间还存在相互作用关系，B2R抑制剂的运用能明显抑制B1R的表达，而B1R抑制剂对B2R的表达无显著影响。研究提示：1、脑缺血早期，缓激肽B1和B2受体均能加重缺血后组织损伤。2、脑缺血后期，缓激肽B2受体能够抑制缺血导致的细胞凋亡。3、B2受体激活可以增加B1受体的表达。第三部分：缓激肽受体在缺糖、缺氧神经元细胞凋亡中的作用本研究体内实验观察到缓激肽B1R和B2R对脑缺血后细胞凋亡的影响显著不同。为排除体内复杂微环境的影响，本部分采用缺氧、缺氧（OGD）—复糖、复氧神经元模型，利用缓激肽受体的特异性激动剂和抑制剂进行干预，以深入探讨两者在神经元细胞凋亡中的作用。体外原代培养大鼠皮层神经元，以培养第7～10天，生长状态良好的神经元进行相关实验。OGD 1.5h后复糖、复氧，MTT测定细胞存活率，以确定复糖、复氧时间。免疫荧光双标测定缓激肽B1R和B2R在体外培养神经元中的表达。分别采用B1R激动剂（des-Arg9-BK，1μmol／L）、B2R激动剂（BK，1μmol／L）、B1R抑制剂[Lys-（des-Arg9-Leu8）-BK，100nmol／L]、B2R抑制剂（HOE140，100nmol／L）在OGD前24h进行干预，复糖、复氧后4h采用TUNEL测定细胞凋亡。结果：1、缓激肽B1R和B2R在体外培养的神经元中均有表达，缺糖、缺氧后两者的表达量有所提高。2、OGD 1.5h复糖、复氧4h，细胞存活率下降50％。3、B1R激动剂和B2R抑制剂能够促进OGD所导致的神经元凋亡；而B1R抑制剂和B2R激动剂能够对OGD所导致的神经元凋亡发挥抑制作用。研究提示：1、B1受体可以增加OGD所致的神经元凋亡。2、B2受体能够拮抗OGD导致的神经元凋亡。结论1．缓激肽B1受体：脑缺血再灌流后表达迅速上调。主要分布于反应增生的星形胶质细胞，可增加血脑屏障通透性，促进炎性因子的释放，加重缺血导致的脑损伤；神经元上分布的B1受体激活可增加OGD引起的神经元凋亡。2．缓激肽B2受体：脑缺血再灌流后表达缓慢上调。主要分布于缺血周边区皮层神经元，可起到拮抗神经元凋亡的作用；但在缺血早期B2受体的激活可通过增加B1受体的表达，加重缺血导致的脑损伤。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 激肽释放酶—激肽系统在脑缺血后的动态表达
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 缓激肽受体在脑缺血后不同时期的作用研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 缓激肽受体在缺糖、缺氧神经元细胞凋亡中的作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 综述
• 参考文献
• 发表文章
• 致谢