应用嗜热脂肪芽胞杆菌检测原料奶中抗生素残留的研究

论文摘要

本文主要应用包埋的嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞检测牛奶中的抗生素残留,对营养物质、指示剂添加量、包埋条件以及检测条件等指标进行了研究,以提高此方法的灵敏度与稳定性。然后通过与小样发酵法、国标TTC法、试剂盒（ECLIPSE50）法、试纸条法四种方法作对照,统计阳性率,进一步确认本研究方法的可行性与灵敏度。本试验研究主要包括以下几个方面的内容:（一）首先将从普通微生物菌种保藏中心购买的试验菌（ATCC12980=NCTC10339）进行复壮、优化,在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上培养,让其在65℃、pH值7.2条件下生长,挑选生长比较快速的菌落。但嗜热脂肪芽胞杆菌只形成针头大小的菌落,为革兰氏阳性菌。（二）嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞的制备。本试验,芽胞悬浮液中的营养菌体可选择两种方法除去,一是用溶菌酶法,二是加热离心法。通过两种方法的对比,并且考虑到成本因素,本文选择加热离心法。斜面菌种培养后,用生理盐水洗下菌苔,振荡,过滤,制成一定浓度的悬浮液进行加热离心制备芽胞。悬浮液70℃加热10 min在有效除去营养菌体碎片的情况下比更高温度、加热更长时间下存活的芽胞数量多,效果最好。（三）嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞包埋:通过对比卡拉胶、结冷胶、瓜尔胶和海藻酸钙四种包埋剂的凝胶强度、扩散性以及操作的简易程度,选择海藻酸钙作为嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞的包埋剂。（四）营养要求的研究,利用正交试验选择的最优营养液配方是:葡萄糖的添加量为1%,蛋白胨为1%。营养液的pH值控制在7.2左右,1.6%的指示剂的添加量为每100 mL营养液加入0.06 mL。（五）确定检测条件:处理好的牛奶样品检测时,每个检测小管内添加0.2 mL紫色营养液,再加入牛奶样品0.1 mL。在65℃水浴培养150 min。取检样200份,检测时间为135 min,其中173份为阴性,27份为阳性,没有可疑样品,阳性率为13.5%,本研究方法具有可行性。（六）稳定性试验:将制备好的检测小管在4℃保存1周、2周、3周以及4周,记录其阴性检测时间分别为前三周都是135 min,第四周检测时间开始增加为150 min,但也在检测时间范围内,所以本方法的检测稳定性为一个月。（七）与小样发酵法、国标（TTC）法、试剂盒法及试纸条法对照试验:制备相同检样各40份,分别采取小样发酵法、TTC法（国标GB5409-85）、试剂盒法（ECLIPSE50）和试纸条法（青霉素类）与本方法进行对照检测其灵敏度。阳性率分别为小样发酵法22.5%,TTC法25%,本方法23.75%,试剂盒法26.25%,试纸条法32.5%。本研究方法的灵敏度介于小样发酵与试剂盒法之间,灵敏度具有可靠性。小样发酵法的灵敏度较低,国标TTC法可疑样品份数较多且操作比较复杂,菌液浓度难以控制。试剂盒法和试纸条法操作都比较简单,其中试纸条法时间比较短,但它们经过商品化,成本较高,适合于研究试验室应用,不便于在一般的养殖场和收奶站中推广使用。本课题目的在于根据现有的检测方法对嗜热脂肪芽胞杆菌检测牛奶中抗生素残留的方法加以改进及创新,建立一种简单、快速、灵敏度高、能够普遍推广应用的抗生素残留检测方法。该检测方法通过与其他方法作对照,在检测时间和灵敏度方面都能达到要求,而且成本大大降低,所以本研究方法具有可行性。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 牛奶中抗生素残留的种类及体内代谢途径
• 1.1.1 牛奶中抗生素残留的种类
• 1.1.2 青霉素类抗生素体内代谢途径
• 1.2 牛奶中抗生素残留的来源及其危害
• 1.2.1 牛奶中抗生素残留的来源
• 1.2.2 牛奶中抗生素残留的危害
• 1.3 各个地区政府管理组织
• 1.3.1 世界卫生组织（WHO）及粮农组织（FAO）
• 1.3.2 发达国家对兽药使用的立法和组织管理
• 1.3.3 我国的管理现状
• 1.4 牛奶中抗生素残留的现状
• 1.5 牛奶中的抗生素残留检测方法
• 1.5.1 TTC 法
• 1.5.2 BSDA 法
• 1.5.3 Delvotest P 法（戴尔沃检测法）
• 1.5.4 纸片法
• 1.5.5 阻抗分析法
• 1.5.6 理化检测法
• 1.5.7 生物传感器法
• 1.5.8 SNAP 法
• 1.6 减少和避免抗生素残留的措施
• 1.7 微胶囊技术的研究进展
• 1.8 本课题的目的、意义及研究内容
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 仪器
• 3.3 试验器皿
• 3.4 培养基制备方法及试剂配制
• 3.4.1 胰蛋白胨大豆琼脂培养基
• 3.4.2 芽胞培养基
• 3.4.3 10%的无抗生素的脱脂奶粉的配制
• 3.4.4 试验试剂
• 3.5 试验方法
• 3.5.1 菌种复苏
• 3.5.2 嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞悬浮液的制备
• 3.5.3 嗜热脂肪芽胞杆菌的微胶囊化
• 3.5.4 营养液配方正交试验
• 3.5.5 营养液中指示剂以及pH 值的确定
• 3.5.6 牛奶阳性、阴性样品的制备
• 3.5.7 检测应用
• 3.5.8 稳定性试验
• 3.5.9 与其他检测方法的对照试验
• 3.5.9.1 小样发酵法
• 3.5.9.2 TTC 法按国标 GB5409—85 进行
• 3.5.9.3 试剂盒法（ECLIPSE50）
• 3.5.9.4 试纸条法（青霉素）
• 4 结果与分析
• 4.1 菌株恢复、优化培养
• 4.2 芽胞悬浮液的制备
• 4.3 嗜热脂肪芽胞杆菌的胶体包埋
• 4.3.1 几种胶体包埋的比较
• 4.3.2 海藻酸钠包埋
• 4.3.2.1 海藻酸钠对细胞活性的影响
• 2浓度对固定化细胞凝胶机械强度的影响'>4.3.2.2 CaCl₂浓度对固定化细胞凝胶机械强度的影响
• 2浓度对固定化细胞活性的影响'>4.3.2.3 CaCl₂浓度对固定化细胞活性的影响
• 4.3.2.4 芽胞悬浮液的微胶囊化方法
• 4.3.3 海藻酸钙凝胶珠
• 4.4 营养液配方
• 4.5 指示剂及 pH 对培养基颜色变化的影响
• 4.6 测试条件
• 4.7 包埋芽胞与未包埋芽胞的比较
• 4.8 稳定性试验
• 4.9 各方法比较
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 参考文献
• 英文摘要