论文摘要
研究背景MxA蛋白由662个氨基酸残基组成,是大GTP酶蛋白超家族成员和动力素超家族成员,分子量为76KD。MxA蛋白有GTP酶活性,即该蛋白有结合GTP的活性和水解GTP能力。MxA蛋白通过N端氨基酸GTP结合元件结合外源性GTP;C端氨基酸含有GTP酶水解效应区,能够将内源或外源GTP降解为GDP。MxA第83位氨基酸位于N端GTP结合元件的关键位点,K83A变异MxA蛋白失去结合GTP的能力,但C端GTP酶水解效应区仍能降解外源性GTP;第612位氨基酸位于MxA蛋白C端GTP酶水解活性区域,L612K变异MxA蛋白失去酶解内源或外源GTP活性,但仍能通过N端GTP结合元件结合GTP。第103位氨基酸是位于MxA蛋白N端GTP结合元件的另一关键位点,T103A变异MxA同时失去结合GTP能力和水解GTP的活性。由于K83A、T103A和L612K位点变异MxA蛋白与GTP酶功能密切相关,因此,它们较多用于MxA蛋白GTP酶活性相关功能的研究。MxA蛋白抗RNA病毒活性与其自身的GTP酶活性密切相关,即MxA蛋白可能在结合和分解GTP的同时发挥抗病毒作用。K83A位点变异不能抑制Influenza A virus,Vesicular stomatitis virus复制;T103A变异MxA蛋白失去对Influenza A virus,Vesicular stomatitis virus,Togoto virus的抑制作用;L612K变异MxA蛋白虽然失去了降解GTP的能力,能够抑制Thogovirus和Vesicular stomatitis virus的复制,但较野生型蛋白抑制能力下降10倍。E645R变异发生在MxA蛋白C段GTP酶功能区域第二个亮氨酸拉链结构,该位点变异不影响GTPase活性（结合GTP和水解GTP的能力均不受影响）,但特异性的失去抗LACV（la cross virus）、CCHFV（crimean-congo hemorrhagic fevervirus）活性和VSV活性而保留对Influenza A virus和THOV（Thogoto virus）的抑制活性。近年有报道MxA蛋白对DNA病毒乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）也有明显的抑制作用,但GTP酶活性是否对MxA蛋白抑制HBV复制活性有着关键性的影响尚不清楚。体外研究表明MxA蛋白特异性的干扰RNA病毒核壳组装和形成可能是其发挥抗病毒作用的主要机理,但MxA并不能直接与HBV核壳蛋白相互作用;MxA抑制HBV复制的过程中对病毒总RNA水平没有影响,但导致核内前基因组RNA（pregenomic3.5kbmRNA,pgRNA）增多而胞浆分布明显减少,推测MxA蛋白可能通过抑制pgRNA从核内向胞浆转运从而抑制HBV复制;乙型肝炎病毒转录后调节元件（Hepatitis B virus posttranscriptional regulatory element,HPRE）是介导pregenomic3.5kbmRNA核外移的关键元件之一,体外实验表明MxA可作用于HPRE序列介导的mRNA核外移;推测MxA蛋白可能通过影响HPRE介导的pgRNA核外移从而影响HBV蛋白合成、包装和抗原的分泌。但MxA蛋白是否在核内或核周发挥这一作用?通过提高核内核周MxA蛋白浓度是否能提高其抑制HBV复制能力?这些问题尚未见报道。研究目的1、研究MxA蛋白在HepG2细胞中抑制HBV复制活性。2、E645R变异是否影响MxA蛋白抑制HBV复制活性。3、GTP酶活性是否是影响MxA蛋白抑制HBV复制的关键因素。4、MxA蛋白是否主要抑制HBV的核内复制阶段。研究方法1、野生型和GTPase缺陷型MxA蛋白表达载体的鉴定:pcDNA3.1-Flag-MxA（wild-type）,pcDNA3.1-Flag-MxA-K83A,pcDNA3.1-Flag-MxA-T103A和pcDNA3.1-Flag-MxA-L612K重组载体转化DH5α,挑选阳性克隆,经过PCR鉴定和双酶切鉴定后进一步测序鉴定;测序结果与pubmed公布序列通过DNAsis软件比对。用HiSpeed Plasmid Midi Kit（Qiagen）中量抽提以上各质粒和空质粒pcDNA3.1（+）。2、野生型MxA蛋白抑制HBV复制活性研究:用HiSpeed Plasmid Midi Kit（Qiagen）大量抽提重组质粒pU19-1.24HBV。常规方法培养HepG2细胞。按5×106细胞/皿将细胞接种到直径10cm细胞培养皿中培养24小时细胞贴壁后待转染。转染方案采用pcDNA3.1-Flag-MxA和pU19-1.24HBV重组质粒分别按1:1和2:1比例共转染,pSeap质粒平衡转染效率,转染重复三次。转染时脂质体lipofectineTM 2000与总DNA量比例为2:1,转染3天后收集细胞和上清。Westernblot检测Flag-MxA蛋白表达;Abbott检测上清HBsAg和HBeAg水平,real-timePCR检测细胞内外HBV DNA水平。3、检测Flag-MxA蛋白抑制HBV过程中是否发生降解:实验组取pcDNA3.1-Flag-MxA和pU19-1.24HBV重组质粒分别为10μg和5μg共转染;对照组取pcDNA3.1-Flag-MxA重组质粒10μg,pU19质粒和Salmon DNA共5μg共转染HepG2细胞,两组pSeap质粒均取0.3μg,转染3天后,收集细胞裂解,蛋白定量后western blot检测细胞内Flag-MxA蛋白表达水平。4、检测Flag-MxA蛋白抑制HBV过程中是否发生重新分布:实验组取pcDNA3.1-Flag-MxA和pU19-1.24HBV重组质粒分别为10μg和5μg共转染HepG2细胞;对照组取pcDNA3.1-Flag-MxA重组质粒10μg,pU19质粒和SalmonDNA共5μg共转染HepG2细胞,3天后取出载玻片,常规方法使用anti-Flag单克隆抗体染Flag-MxA蛋白,HO33342染细胞核,激光共聚焦观察Flag-MxA蛋白在细胞核内外分布。5、E645R变异MxA重组载体（pcDNA3.1-Flag-MxA E645R）构建:我们在pcDNA3.1-Flag-MxA重组质粒基础上采用定点突变获得pcDNA3.1-Flag-MxAE645R重组质粒。定点突变采用Quick Change定点突变试剂盒,引物设计按照试剂盒要求设计完成。PCR反应体系按说明书要求进行,产物经DpnI酶切后酶切产物转化感受态细菌,涂布于含氨苄青霉素LB平板上,筛选阳性克隆,PCR鉴定和小量抽提重组质粒酶切鉴定后送测序鉴定。6、E645R变异MxA蛋白抑制HBV复制活性研究:常规方法培养HepG2细胞接种到直径10cm细胞培养皿中,培养24小时细胞贴壁后待转染。转染方案采用pcDNA3.1-Flag-MxA 10μg和pU19-1.24HBV 5μg重组质粒共转染HepG2细胞,各皿取pSeap质粒0.3μg共转染,重复三次;转染3天后收集细胞和上清;western blot检测Flag-MxA蛋白表达;abbott检测上清HBsAg和HBeAg的水平,real-time PCR检测细胞内外HBV DNA水平。7、GTP酶缺陷型MxA变异体对HBV复制的影响:常规方法培养HepG2细胞接种到直径10cm细胞培养皿中,培养24小时细胞贴壁后待转染。取5μg pU19-1.24HBV重组质粒分别和10μg pcDNA3.1-Flag-MxA（wild-type）,10μg pcDNA3.1-Flag-MxA（K83A）,10μg pcDNA3.1-Flag-MxA（T103A）,10μg pcDNA3.1-Flag-MxA（L612 K）共转染HepG2细胞;对照组取pcDNA3.1质粒和Salmon DNA共10μg,pSeap质粒0.3μg平衡转染效率,共重复三次。转染3天后Western blot检测Flag-MxA蛋白表达:Abbott检测上清HBsAg和HBeAg的水平;real-time PCR检测细胞内外HBV DNA水平。8、野生型MxA蛋白和T103A变异蛋白的核内表达型重组载体（pcDNA 3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103）的构建:pcDNA3.1-HA-MxA（wild-type）和pcDNA 3.1-HA-MxA（T103A）两种载体转化DH5α,挑选阳性克隆,经过PCR和双酶切鉴定后进一步测序鉴定。测序结果与pubmed公布序列通过DNAsis软件比对。人工合成SV40大T抗原核内转移信号肽的上下游单链的DNA片段（均为66bp,上、下游分别含有HindⅢ和EcoRI酶切位点）。将上下游DNA单链各取5μl进行”55℃,30sec;72℃,30sec”一个反应循环将两条单链变成双链DNA。pcDNA3.1-HA-MxA（wild-type）和pcDNA3.1-HA-MxA（T103A）两种载体通过HindⅢ和EcoRI双酶切后琼脂糖回收;酶切后的pcDNA3.1-HA-MxA（wild-type）和pcDNA3.1-HA-MxA（T103A）载体分别与SV40大T抗原双链DNA和通过T4连接酶进行连接反应。连接产物转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆菌PCR鉴定后送测序。9、MxA蛋白核内表达型抑制HBV复制研究:pcDNA3.1-HA-MxA（wild-type）和pcDNA3.1-HA-MxA（T103A）与各自核内表达型载体（pcDNA3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103）使用HiSpeed Plasmid Midi Kit提取质粒。随后取5μgpU19-1.24HBV质粒分别与5μg对照组DNA、5μg MxA载体和5μg T103A（103）载体,5μg TMxA载体和5μg T103载体共转染HepG2细胞。pSeap取0.3μg平衡转染效率,转染3天后收集细胞上清和细胞裂解液,abbott检测上清HBsAg和HBeAg;Real-time PCR检测细胞内和细胞外HBV DNA水平。结果1、MxA表达载体鉴定:pcDNA3.1-Flag-MxA（wild-type）,pcDNA3.1-Flag-MxA-K83A,pcDNA3.1-Flag-MxA-T103A和pcDNA3.1-Flag-MxA-L612K重组载体经酶切和测序鉴定并与PUBMED公布的人MxA序列比对表明各载体序列正确。定点突变获得的pcDNA3.1-Flag-MxA E645R载体经测序序列正确。pcDNA3.1-HA-MxA and pcDNA3.1-HA-T103A经酶切和测序表明序列正确;核内表达型载体pcDNA3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103测序结果也表明正确插入了SV40大T抗原核内转移信号肽。2、野生型MxA蛋白抑制HBV复制结果:Western blot检测pcDNA3.1-Flag-MxA重组质粒和pU19-1.24HBV重组质粒按1:1、2:1共转染HepG2细胞时,按2:1比例共转染时MxA蛋白表达较1:1时强。与对照组相比,按1:1比例转染时MxA组HBeAg下降27%,HBsAg与对照组差别没有显著性意义（P＞0.05）。转染比例按2:1比例转染时MxA组的HBeAg较对照组下降65%,差别有显著性意义（P＜0.01）;HBsAg与对照组下降21%（P＜0.05）。各组上清进行real-time PCR检测显示1:1转染时MxA组较对照组上清HBV DNA水平分别下降1.05个log10值,细胞内HBVDNA下降0.68个log10值。2:1转染时MxA组较对照组上清HBV DNA水平下降1.91个log10值,细胞内HBVDNA下降1.69个log10值。3、抑制HBV复制时MxA蛋白的表达和分布:Western blot检测结果显示MxA蛋白抑制HBV组与对照组MxA蛋白表达没有明显差别;激光共聚焦显微镜显示在没有HBV复制的HepG2细胞中Flag-MxA蛋白主要分布于细胞浆,而在HBV复制的HepG2细胞中Flag-MxA蛋白部分发生了核内移。4、MxA蛋白E645R变异载体抑制HBV复制:Western blot检测结果表明MxA组和E645R组有较好的Flag-MxA蛋白表达;MxA组和E645R组上清进行abbott检测显示MxA组和E645R组HBsAg较对照组分别下降21%和24%;HBeAg分别下降65%和59%,差异具有显著意义（P＜0.01）。MxA组和E645R组间HBsAg和HBeAg表达水平差异没有显著性意义（P＞0.05）。各组进行real time PCR检测显示MxA组和E645R组较对照组上清HBV DNA水平分别下降1.91个和2.22个log10值,细胞内HBVDNA分别下降下降1.69和1.70个log10值。5、GTPase活性缺陷型载体对HBV复制的抑制:Western blot结果显示各组MxA蛋白均有较好的表达,对照无表达。与对照组相比,上清中的HBeAg在野生型组、K83A、T103A和L612K变异组的表达分别下降73%,71%,73%和70%（P＜0.01）;上清的HBsAg水平在野生型组、K83A、T103A和L612K变异组的表达分别下降41%,41%,44%和41%（P＜0.01）;上清HBVDNA水平分别下降2.22,2.11,2.23和2.18 log10（P＜0.01）,细胞内HBVDNA水平下降1.89,1.78,1.72和1.93 log10（P＜0.01）。在K83A、T103A和L612K变异组上清HBVDNA水平、HBsAg和HBeAg水平和细胞内的HBVDNA水平与野生型组比较差异没有显著性意义（P＞0.05）。6、TMXA和T103抑制HBV复制的结果:Western blot结果显示各组均有较好的HA-MxA蛋白表达。激光共聚焦结果显示在转染TMxA和T103载体的HepG2细胞中,MxA蛋白主要以细胞核内表达为主;而胞浆型MxA载体和T103A载体在抑制HBV过程中仅部分核内移,说明我们的核内表达型载体提高了MxA的核内表达浓度。与对照组相比,在MxA,TMxA,103和T103组,细胞外HBeAg水平下降28%,9%,28%和10%;细胞外HBV DNA水平分别下降88%,44%,88%和39%;细胞内HBV DNA分别下降81%,35%,76%和42%。TMxA和T103组细胞外HBeAg水平和胞内胞外HBVDNA水平均显著低于对照组（P＜0.01）,但分别显著高于MxA和103组的水平（P＜0.01）。结论1、MxA蛋白在HepG2细胞中抑制HBV复制;E645R变异不影响MxA蛋白抑制HBV复制活性。2、MxA在抑制HBV过程中可能不发生降解但发生核内移,MxA蛋白核内移的机理仍在进一步研究中。3、GTP酶缺陷型MxA载体（K83A,T103A,L612K）抑制HBV复制的活性与野生型MxA蛋白抑制活性基本相当,推测GTP酶活性对MxA抑制HBV复制活性没有关键性的作用。4、提高核内表达的MxA蛋白不能提高其抑制HBV的复制活性,提示MxA蛋白可能只轻微作用于HBV核内的复制过程;MxA蛋白可能作用于HBV复制的多个阶段。