论文摘要
第一部分人大隐静脉平滑肌细胞的体外培养、获得与鉴定目的探讨体外原代培养、扩增人大隐静脉平滑肌细胞（VSMC）的方法,为后续实验提供充足的细胞。方法无菌条件下取冠状动脉旁路移植术中大隐静脉3～8cm,应用组织块培养法在DMEM培养液中原代培养,传代,扩增。倒置显微镜、免疫细胞化学方法对平滑肌细胞进行鉴定。结果倒置显微镜结果显示:原代细胞经传代培养后的细胞,呈现平滑肌细胞生长的特征。免疫细胞化学检测示平滑肌α-肌动蛋白呈阳性反应。细胞经3～5代培养后,细胞数量可达到8～10×106。结论组织块培养法原代培养可获得VSMC,且数量丰富,为后续实验打下良好基础。第二部分骨桥蛋白下调对大隐静脉VSMC增殖和迁移能力影响的实验研究目的大隐静脉VSMC的过度增生和迁移是静脉桥内膜增生的主要病理基础,本部分研究骨桥蛋白（OPN）下调对大隐静脉VSMC增殖和迁移能力的影响,并探讨可能机制。方法原代培养的VSMC转染小干涉RNA（siRNA）,用实时定量PCR、免疫印迹法和ELISA法检测OPN表达以明确干涉效果,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）和Transwell膜法观察VSMC增殖和迁移的能力,并用免疫印迹法检测基质金属蛋白酶（MMPs）表达情况。结果OPN siRNA有效干涉了VSMC OPN的表达,减低了MMP-2、MMP-9蛋白的表达,抑制了血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力。结论OPN通过调控MMP-2、MMP-9表达,对大隐静脉平滑肌细胞的增殖和迁移特性具有重要意义。第三部分骨桥蛋白下调对血管紧张素Ⅱ诱导的大隐静VSMC炎症特性影响的实验研究目的静脉桥1年后,在内膜增生的基础上发生粥样硬化。VSMC的炎症活化特性是粥样硬化发生的细胞学基础。本部分,我们研究OPN下调对血管紧张素Ⅱ诱导的VSMC炎症特性的影响,为静脉桥粥样硬化的防治提供理论依据。方法原代培养的VSMC转染OPN siRNA,用实时定量PCR、免疫印迹法和ELISA法检测OPN以明确干涉效果,并用血管紧张素Ⅱ刺激各组细胞诱导VSMC炎症激活。用凝胶电泳迁移率变化分析法分析核因子κB（NFκB）和转录因子活化蛋白1（AP-1）激活情况,用ELISA法分析培养液白介素6（IL-6）含量来测定炎症激活情况。结果OPN siRNA有效干涉了VSMC OPN的表达,抑制了NFκB和AP-1的激活,减少了IL-6分泌,即抑制了VSMC的炎症激活。结论OPN在血管紧张素Ⅱ诱导的VSMC炎症激活中具有重要作用,可作为防治粥样硬化疾病的新靶点。第四部分骨桥蛋白下调对大隐静脉VSMC钙化特性影响的实验研究目的静脉桥粥样斑块及桥血管壁皆可发生钙化,而VSMC是钙化的细胞学基础,本部分研究OPN下调对大隐静脉VSMC钙化特性的影响。方法原代培养大隐静脉VSMC,转染OPN siRNA,用实时定量PCR、免疫印迹法和ELISA法检测OPN以明确干涉效果。在此基础上用β甘油磷酸盐（β-GP）诱导VSMC发生钙化,测定细胞钙沉积和碱性磷酸酶（ALP）活性。结果OPN siRNA有效干涉了VSMC OPN的表达,OPN下调使得细胞钙沉积明显增加,而对ALP活性无影响。结论OPN的下调增加了细胞钙沉积,OPN的作用环节在ALP的下游,起到抑制VSMC钙化作用。进一步的研究在于开发出既能抑制VSMC增殖、迁移、炎症相关功能表位,又能无损OPN抗VSMC钙化功能表位的药物。
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标签：大隐静脉论文; 血管平滑肌细胞论文; 原代培养论文; 骨桥蛋白论文; 干涉论文; 增殖论文; 迁移论文; 炎症论文; 钙化论文;