论文摘要
恶性黑素瘤是一种高度恶性的黑素细胞肿瘤,皮肤是其主要累及部位之一。皮肤恶性黑素瘤的发病率逐年增加,其死亡例数占所有皮肤肿瘤的80%。BAG-1是一种多功能蛋白,在多种肿瘤的发生、发展及放、化疗治疗反应中有重要的生物学作用。但BAG-1蛋白在皮肤黑素瘤组织中的表达情况及其临床意义尚未见报道,BAG-1在黑素瘤发生、发展中的具体作用及其机制更不清楚。目的探讨BAG-1在皮肤黑素瘤的表达及其与临床病理特征的相关性;RNAi抑制BAG-1基因表达,研究其对小鼠黑素瘤B16F10细胞株的细胞周期、增殖、凋亡及多西紫杉醇治疗反应的影响。材料与方法第一部分:免疫组化检测BAG-1、p53、Bcl-2在皮肤恶性黑素瘤、色素痣、正常人皮肤的表达,结合患者临床资料（性别、年龄、Clark分级等）进行分析;检测BAG-1在黑素瘤细胞株M14和B16F10细胞的表达。第二部分:以pRNAT-U6.1/Neo为载体,构建重组shRNA质粒pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-1、-2、-3,酶切及PCR测序鉴定;利用lipofectaminTM 2000将重组质粒转染小鼠黑素瘤B16F10细胞,设阴性对照组（转染阴性对照质粒Neg）和空白对照组（未转染组）,转染48 h后,荧光显微镜下检测转染效率,G418筛选阳性克隆并扩增;用RT-PCR、western blot法分别检测BAG-1基因mRNA、蛋白的表达,筛选干扰效率最高的shRNA质粒pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3。第三部分:分别培养空白对照组、阴性对照组细胞及转染pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3的细胞,流式细胞仪分析细胞周期,MTT法和平皿克隆形成实验检测细胞增殖能力,TUNEL法检测细胞凋亡,并在显微镜下计数每500个细胞中凋亡细胞的数值;MTT法计算多西紫杉醇对B16F10细胞的增殖抑制率,进一步以多西紫杉醇10 umol/L的浓度分别处理空白对照组、阴性对照组及转染pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3组细胞,于加药后24 h、48 h,流式细胞仪检测细胞周期,TUNEL法检测细胞凋亡。结果第一部分:BAG-1在正常皮肤不表达,在皮肤恶性黑素瘤的阳性表达率为78%,显著高于色素痣组15%（P＜0.001）,BAG-1蛋白在皮肤恶性黑素瘤中的表达与Clark分级呈正相关（r=0.47,P＜0.05）。第二部分:酶切及测序结果证实重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-1、-2、-3构建成功。质粒在B16F10细胞的转染效率为20～30%。阴性对照组的BAG-1基因表达水平与空白对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）;与阴性对照及空白对照组相比,shRNA质粒转染组的BAG-1基因表达显著下降（P＜0.05）,其中以pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3抑制效率最高,抑制率在mRNA和蛋白水平分别为（77±4）%和（62±2）%。第三部分:与阴性对照组及空白对照组细胞相比,转染pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3组细胞出现以下变化:细胞周期S期细胞增多;生长速度减慢,形成的细胞克隆数值减少;凋亡细胞数值增多,差异有统计学意义（P＜0.05）。多西紫杉醇10 umol/L处理后24 h,各组细胞均表现为G2期细胞百分比升高;处理后48 h,转染pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3组的G2期细胞百分比明显高于阴性对照及空白对照组（P＜0.05）。多西紫杉醇10 umol/L处理后24 h及48 h,转染pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3组凋亡细胞数值均明显高于阴性对照及空白对照组（P＜0.05）。结论BAG-1在皮肤恶性黑素瘤组织中的表达显著升高,其表达水平与Clark分级呈正相关;针对小鼠BAG-1基因的shRNA真核表达质粒pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3能高效、特异地抑制小鼠黑素瘤B16F10细胞BAG-1基因的表达:干扰BAG-1基因表达能影响小鼠黑素瘤B16F10细胞的细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡及其对多西紫杉醇的治疗反应,表现为明显的S期阻滞、细胞生长速度和克隆形成能力明显降低、凋亡细胞数目显著增加、对多西紫杉醇处理所诱导的细胞周期G2期阻滞、细胞凋亡的敏感性明显增加。