中国野生葡萄APX基因遗传转化拟南芥的研究

论文摘要

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase,APX）是叶绿体中清除H2O2的关键酶,它可以为各种胁迫所激活。本研究中通过对获得的基因全长进行序列分析,设计引物构建了该基因的过量表达载体和RNA干扰（RNA interference,RNAi）载体,然后通过花絮浸润（folral dip）法转化拟南芥,经抗生素筛选、PCR检测和荧光定量PCR（Real-time PCR）检测获得的T3代转化植株,并对其进行水杨酸（salicylic acid,SA）喷施,研究水杨酸对该基因的诱导作用,另外对转化苗进行盐胁迫处理,研究该基因在盐胁迫中的功能,这为今后分析水杨酸与该基因的相互作用提供了参考,同时也为改善葡萄甚至其它园艺作物抗性提供了有效基因。本研究的主要结果如下:1、构建了中国野生葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因植物过量表达载体和RNA干扰载体通过BamHI和SalI双酶切,将PWR306-APX中的APX基因全长构建到过量表达载体PWRII中,双酶切鉴定表明,成功构建了中国野生葡萄的APX基因植物过量表达载体。根据APX基因序列设计引物,应用Gateway技术,将该基因片段构建到RNAi载体PHellsgate8中,经酶切检测表明,成功构建了中国野生葡萄APX基因的RNAi载体。2、研究了中国野生葡萄APX基因转化植株中mRNA的相对表达量采用folral dip法转化拟南芥,分别用50mg/ml Hyg和40mg/ml Kan对T1代转化植株的种子进行抗性筛选,提取阳性植株的DNA,PCR检测潮霉素基因和APX基因,结果表明,获得了两种拟南芥阳性转化苗。分别提取T3代突变体的RNA,并进行Real-time PCR检测,结果表明,过量表达突变体中的APX基因mRNA相对表达量远远超出野生拟南芥,而RNA沉默突变体中的APX基因mRNA相对表达量低于野生拟南芥。3、研究了SA对中国野生葡萄APX基因诱导作用对获得的中国野生葡萄过量表达的拟南芥小苗喷施2mM的SA,72h后分别提取RNA,Real-time PCR分析表明:转化苗和野生拟南芥在SA处理后APX基因mRNA相对表达量均比SA处理前要高,分别是处理前的1.33倍和1.29倍,由此认为SA对中国野生葡萄APX基因具有诱导作用。4、分析了中国野生葡萄APX基因对拟南芥盐胁迫耐受力的影响将获得的转基因T3代拟南芥种子和野生型拟南芥种子分别播种于分别含有NaCl浓度为0、100mM、125mM、150mM、175mM的MS固体培养基上,计算其发芽率和根长衡量其抗盐能力,结果显示:在同一处理浓度下,过量表达拟南芥、基因沉默拟南芥和野生拟南芥的发芽率差别不大;随着NaCl浓度的不断增加,三者发芽率均逐渐降低,当NaCl浓度为175mM时,发芽率降低至50%～70%,而且在此浓度下三者生长均受到严重抑制,几乎全是畸形苗;转基因拟南芥和野生型拟南芥均随着NaCl浓度增加根长逐渐变短,而在同一NaCl浓度下,过量表达拟南芥的根最长,根系生长最健壮,而基因沉默拟南芥的根最短最细,野生型拟南芥处中间水平,由此认为中国野生葡萄APX基因可以提高拟南芥盐胁迫耐受力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物基因功能研究方法
• 1.1.1 转移DNA 标签法
• 1.1.2 转座子标签法
• 1.1.3 反义RNA 技术的基因敲除
• 1.1.4 基因陷阱
• 1.1.5 化学诱变的新发展———TILLING 技术
• 1.1.6 RNA 干扰技术
• 1.2 抗坏血酸过氧化物酶
• 1.2.1 植物体中活性氧的产生及其清除
• 2O₂ 的产生和清除以及抗坏血酸过氧化物酶的作用机制'>1.2.2 叶绿体中H₂O₂的产生和清除以及抗坏血酸过氧化物酶的作用机制
• 1.2.3 抗坏血酸过氧化物酶的反应机制
• 1.2.4 抗坏血酸过氧化物酶的系统分布
• 1.2.5 抗坏血酸过氧化物酶的分子生物学研究
• 1.3 水杨酸与植物诱导抗病性
• 1.3.1 水杨酸生物合成途径
• 1.3.2 植物诱导抗病性
• 1.3.3 水杨酸介导的抗病信号转导途径
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 模板与引物
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 质粒和菌
• 2.1.4 酶与化学试剂
• 2.1.5 常用抗生素贮存液
• 2.1.6 培养基及缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 抗坏血酸过氧化物酶基因过量表达载体的构建
• 2.2.2 RNA 干扰载体的构建
• 2.2.3 重组质粒导入根癌农杆菌
• 2.2.4 花絮浸润法转化拟南芥
• 2.2.5 抗生素筛选
• 2.2.6 抗生素筛选的阳性植株PCR 检测
• 3 代筛选'>2.2.7 转化植株T₃代筛选
• 2.2.8 转基因苗水杨酸处理前后转录水平表达量检测
• 第三章 结果
• 3.1 中国野生葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因过量表达载体的构建
• 3.2 中国野生葡萄APX 基因RNAI 载体构建
• 3.2.1 目的基因连接方向检测
• 3.2.2 PHellsgate8-APX 酶切检测
• 3.2.3 根癌农杆菌的转化及鉴定
• 3.3 花絮浸润法转化拟南芥
• 1 种子的抗性筛选'>3.3.1 T₁种子的抗性筛选
• 3.3.2 抗生素筛选阳性苗的PCR 检测
• 3.4 荧光定量PCR 检测转基因苗水杨酸处理前后转录水平相对表达量
• 3.5 盐胁迫对拟南芥生长的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 花絮浸润法转化拟南芥
• 4.2 水杨酸诱导抗坏血酸过氧化物酶基因表达
• 4.3 抗坏血酸过氧化物酶基因可以提高拟南芥抗盐胁迫能力
• 第五章 结论
• 5.1 构建了中国野生葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因的过量表达载体
• 5.2 构建了中国野生葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因RNA 干扰载体
• 5.3 获得中国野生葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因过量表达的拟南芥突变体
• 5.4 获得中国野生葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因沉默的拟南芥突变体
• 5.5 水杨酸对中国野生葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因具有诱导作用
• 5.6 中国野生葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因可以提高拟南芥盐胁迫耐受力
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介