大豆种子形态建成期与成熟期正反抑制消减文库构建及差异表达基因分析

论文摘要

大豆（Glycine max（L.）Merr.）是我国以及世界上重要的经济作物,其种子油是人类与动物营养以及食品加工业植物食用油的重要来源。大豆油用量占全世界食用油的31%。提高大豆油产量、改善大豆油脂品质,是大豆育种的主要目标。由于大豆种子积累蛋白质和脂肪酸是在种子形态建成中后期开始,至种子脱水干燥期终止,可以通过比较这两个时期差异表达的基因,为大规模的发现重要的影响种子发育及大豆蛋白质与油分形成的关键基因,进一步利用基因工程手段提高大豆种子油含量提供基础。为了分析大豆种子形态建成期与成熟期基因差异表达情况,在测量了高含油量大豆品种中豆32种子不同发育时期脂肪酸和蛋白含量的基础上,选择了开花后15天（15DAF）胚和开花后36天（36DAF）胚为材料,利用抑制性消减杂交技术（suppressionsubtractive hvbridization,SSH）,构建了开花后15天胚和36天胚正反抑制消减文库,在点杂交筛库和阳性克隆测序后,应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对差异表达基因在两个发育不同时期胚中的表达情况进行了定量分析,并初步进行了组织特异性检测,为发现在发育过程中可能影响大豆种子形态建成、油脂合成代谢调控的重要基因及进一步的应用研究提供了重要信息。正反抑制消减文库消减效率均在25以上,消减文库克隆经菌落PCR检测,有效重组率在90%以上,其中插入的cDNA片段大小在100bp到900bp之间,平均大小约434bp,进一步经斑点杂交筛选,从15天胚消减库（正向）和36天胚消减库（反向）中分别挑选476个和471个有效克隆测序,除去测序不成功的以及测序质量不高的克隆,正反消减文库分别获得101和105个ESTs,对所得ESTs在GenBank数据库中进行同源性比对归并后,可将其划分到14个大类中。排除储藏蛋白基因家族后,选取13个差异表达基因（正向库5个,反向库8个）,其中2个和信号转导有关,2个和蔗糖转运有关,2个和脂肪酸转运有关,1个是转录因子,1个是延伸因子,3个和多肽转运、蛋白合成有关,1个与生长素调节有关,1个和葡聚糖磷酸化有关,根据测序结果设计基因特异引物,通过半定量PCR和荧光定量PCR检测了这些差异表达基因在两个不同时期胚中的表达量,其差异倍数从2.84到21.9倍不等。对这些差异表达基因在根、茎、叶、花蕾、荚皮、胚芽等组织中的表达情况作组织特异性检测,仅发现4-662（蔗糖结合蛋白基因）在胚中特异表达,其它基因除了在胚中表达外,还在其它组织中有所表达,有些甚至在所有组织中都有表达,仅在表达量上有所不同。初步结果表明,这些基因很可能与大豆种子油脂合成代谢及其调控有关。为了进一步研究这些基因在大豆种子发育中的作用及参与调控的具体机理,还有待克隆其全长cDNA,通过遗传转化分析其功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1.综述
• 1.1 大豆种子发育
• 1.2 大豆种子脂肪酸合成及基因工程
• 1.3 大豆基因组学研究与EST测序
• 1.4 差异表达基因研究概述
• 1.4.1 mRNA差异显示
• 1.4.2 cDNA代表性差示分析（cDNA-RDA）
• 1.4.3 cDNA微阵列
• 1.4.4 基因表达系列分析（SAGE）
• 1.4.5 抑制性消减杂交（SSH）
• 1.5 研究的目的与意义
• 2.材料和方法
• 2.1 材料及试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA提取及mRNA纯化
• 2.2.2 抑制性消减杂交
• 2.2.3 消减文库构建
• 2.2.4 斑点杂交筛选
• 2.2.5 文库测序及分析
• 2.2.6 差异表达基因的RT-PCR检测
• 2.2.7 差异表达基因的荧光定量检测
• 2.2.8 差异表达基因的组织特异性检测
• 3 结果和分析
• 3.1 总RNA提取
• 3.2 接头连接效率检测
• 3.3 杂交效率检测
• 3.4 PCR检测插入片段
• 3.5 斑点杂交
• 3.6 测序及分析
• 3.7 差异表达基因组织特异性分析
• 4 讨论
• 4.1 消减文库构建
• 4.2 差异表达基因表达模式
• 4.3 能量储存和调控相关基因
• 4.4 发育调控相关基因
• 4.5 蛋白质合成代谢相关基因
• 4.6 油脂合成代谢相关基因
• 参考文献
• 附录
• 致谢