论文摘要
由产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）引起的仔猪腹泻（黄痢和白痢）危害性极大,已使养猪业蒙受巨大经济损失。常用于防治此病的抗生素因耐药与残留问题而备受争议,寻找抗生素替代品尤为必要。噬菌体作为一种新型“抗菌剂”已得到各国科学家的认可。本研究旨在以产肠毒素性大肠杆菌K88为宿主,从猪场环境中分离噬菌体,通过体外和体内试验,评价噬菌体的抗菌效果及安全性,为将噬菌体开发成一款抗菌性饲料添加剂应用于养猪业而提供科学依据。研究包括四个试验：试验一：分离、鉴定产肠毒素性大肠杆菌K88烈性噬菌体,并研究其生物学特性及体外抗菌效果。本试验采用双层平板法从猪场污水样品中分离噬菌体,通过透射电镜观察和基因组酶切分析对获得的噬菌体进行鉴定；同时测定该噬菌体的最佳（投入）感染复数、一步生长曲线、酸碱稳定性、热稳定性及研究该噬菌体体外裂解ETECK88的动态、体外杀灭ETEC K88的效果。通过试验,分离获得一株ETEC K88烈性噬菌体,命名为PK88-4；其噬菌斑清晰透亮,周围无晕环；电镜下,其头部呈正多面体对称,有可伸缩性尾部,属于肌尾病毒科；其核酸类型为双链DNA（基因组大小约60kb）; PK88-4能耐受60℃左右高温、在溶液pH为5-10内效价稳定；最佳（投入）感染复数约为0.01；潜伏期约为10min,爆发期约为40min,裂解量约为40；在体外,PK88-4能于5h内有效杀灭处于对数生长期的ETEC K88.试验二：对ETEC K88标记耐氨苄青霉素基因（ampr）,并以小鼠为试验动物,建立耐氨苄青霉素ETEC K88致死性感染模型,为下一步研究噬菌体的体内抗菌效果提供试验平台。本试验采用氯化钙法制备ETEC K88的感受态细胞,并用热击转化法将质粒pUC19导入感受态细胞。随后,选取42只小鼠,分为7组,对其中的6个组小鼠分别按剂量为4.8×108CFU/200μL,2.6×108CFU/200μL,2.4×108CFU/200μL2.0×108CFU/200nL.1.2×108CFU/200μL和0.6×108CFU/200μL腹腔攻毒ampr标记过的ETEC K88,剩余1组小鼠仅腹腔攻毒等体积的生理盐水,作对照。观察小鼠临床健康状态,记录小鼠死亡时间,统计小鼠存活率；对特定的小鼠做尸检：肉眼观察小鼠腹腔病变情况；取小鼠肝、肾、小肠和脾制作病理切片；测定小鼠腹腔各主要脏器内攻毒菌株的定植数目。选择最合理的攻毒剂量建立小鼠产肠毒素性大肠杆菌致死性感染模型。通过试验,成功制备耐氨苄青霉素的ETEC K88,命名为K88plus;小鼠被不同剂量的K88plus腹腔攻毒后均表现出明显的临床症状；K88plus对小鼠的绝对致死剂量（LD100）为2.0×108CFU/200μL;不小于LD100的K88plus能于攻毒后36h内致死小鼠,而1.3倍LD100剂量能于攻毒后24h内致死小鼠；被不同剂量K88plus感染的小鼠,其腹腔内各脏器均呈现病变征象；被不小于LD100的K88plus致死的小鼠,其腹腔各脏器内均定植有大量K88plus.试验三：利用噬菌体PK88-4预防和治疗小鼠K88plus6勺致死性感染,以分析PK88-4在体内抗菌的可行性。本试验对噬菌体PK88-4采取不同剂量或不同时间腹腔注射的给药方案,来预防和治疗小鼠1.3倍LDl00的K88plus的致死性感染。以注射不含PK88-4的LB培养液作为对照,于试验期后统计小鼠存活率。另外,监测PK88-4和K88plus在小鼠脏器、血液中的定植数量、动态。结果显示,小鼠被腹腔攻毒1.3倍LDloo的K88plus5min后,给药噬菌体,不小于108PFU/500μL剂量的PK88-4能100%治愈感染小鼠（P<0.01）；K88plus攻毒后30min才给药噬菌体,1010PFU/500μL和1011PFU/500μL剂量的PK88-4对感染小鼠的疗效分别为50%（P<0.05）和87.5%（P<0.01）；K88plus攻毒后60min才给药噬菌体,1010PFU/500μL和1011PFU/500μL剂量的PK88-4的疗效分别为12.5%（P>0.05）和75%（P<0.01）；而对小鼠攻毒前120min或60min就给药1010PFU/500μL剂量的噬菌体PK88-4,均有100%的预防效果。在小鼠体内,PK88-4对K88plus显示出极强的杀灭作用。试验四：以小鼠为试验动物,对噬菌体PK88-4的非临床安全性作初步评价,同时研究口服噬菌体PK88-4是否会对小鼠肠道菌群造成影响。本试验采用高剂量PK88-4先对小鼠做急性毒性试验,观察小鼠临床反应,统计小鼠存活率；后又对小鼠进行PK88-4反复给药毒性试验,观察PK88-4对小鼠可能引起的机体病变,测定小鼠血常规和部分血生化指标；对小鼠连续灌胃PK88-4后,取小鼠粪样做变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析。结果显示,24h内连续3次对小鼠腹腔接种1010PFU/200μL剂量的PK88-4,小鼠未出现任何的临床异常表现、死亡；10天内4次对小鼠腹腔接种PK88-4,未引起机体脏器明显的病变,亦未对小鼠血常规和部分血生化指标造成影响；4天内8次对小鼠灌胃PK88-4,未引起小鼠粪样细菌微生物区系的菌群失调。综上所述,本研究新发现的PK88-4是一株能裂解ETECK88的烈性噬菌体；在体外拥有出色的抗菌效果。通过小鼠试验进一步表明,噬菌体PK88-4在体内亦具备极强的抗菌能力；使用安全且不会对小鼠肠道菌群造成危害。
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