论文摘要
冠心病是一种最常见的心脏病,是指冠状动脉粥样硬化使得管腔狭窄或阻塞,导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病,目前发病率日益增高。动脉粥样硬化血栓病变是此类疾病的病理基础,导致病人致死、致残的心血管疾病发病过程,大多数都与动脉血栓形成有关。血管性血友病因子（von Willebrand Factor, vWF）作为动脉粥样硬化血栓形成过程中的关键蛋白,在不同切应力下可以介导动脉血栓形成,是心肌梗死等发病的始动因子之一；vWF的A结构域是其发挥功能的核心结构,尤其是A2结构域内因含有酶切位点而备受瞩目。本课题则将vWF A2结构域作为研究对象,通过对vWF A2结构域三维结构的研究,首次发现了vWF A2结构域中存在一个金属离子结合位点,并综合运用生物化学、分子生物学和生物物理学等方法证明该位点为钙离子结合位点。进一步借助于分子动力学模拟手段和体外酶切的方法,显示钙离子的结合能够稳定A2结构域,导致A2结构域的解螺旋和酶切位点的暴露需要更强的剪切力,从而保护A2结构域不被血管性血友病因子裂解酶（ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif-13, ADAMTS-13）过早酶切,精细调节vWF在血液中剪切压诱导下的酶解。并提出了人体通过血液中钙离子浓度精细调节ADAMTS-13酶解vWF的新机制,从而为vWF A2结构域作为潜在抑制血小板活化的作用靶点、在临床上干预动脉血栓形成提供了实验证据。vWF A2突变体结构域的表达、纯化、结晶和体外酶切调控[目的]通过体外对vWF A2突变体结构域进行表达、纯化和结晶,获得vWF A2结构域三维结构内关于酶切位点的构象变化,比较与野生型A2结构域构象差异,最后通过体外酶切实验进一步明确vWF A2结构域作为潜在抑制血小板活化的作用靶点。[方法]首先借助于常规的分子克隆技术,体外对vWF A2突变体表达载体进行构建；然后将该载体转化至原核表达系统-大肠杆菌菌株中进行表达；运用亲和层析、分子筛、透析等多种手段对表达的蛋白进行纯化；以悬滴气相扩散法对纯化蛋白结晶进行筛选和优化；通过计算机技术对空间结构进行重建；最后借助于免疫印迹技术对vWF A2结构域开展体外酶切实验。[结果]成功实现体外对vWF A2突变体进行了表达和纯化,并于4℃某个最佳结晶条件下拿到了目的蛋白晶体,并对该晶体进行了详细的解析,意外发现了金属离子的存在,并进一步鉴定出该离子为钙离子,通过分子动力学模拟手段和体外酶切的方法,显示钙离子的结合能够稳定A2结构域,导致A2结构域的解螺旋和酶切位点的暴露需要更强的剪切力,从而保护A2结构域不被血管性血友病因子裂解酶ADAMTS-13过早酶切,精细调节vWF在血液中剪切压诱导下的酶解。[结论]该项研究首次发现了vWF A2结构域中的一个钙离子结合位点,提出了人体通过血液中钙离子浓度精细调节ADAMTS-13酶解vWF的新机制,为进一步研究vWF多聚化的调控机制以及冠心病血栓形成的诊治提供了新思路。