链孢粘帚霉HL-1-1寄生核盘菌菌核相关基因的分离鉴定

论文摘要

链孢粘帚霉（Gliocladium catenulatum）是一种分布广泛的土壤习居菌,可寄生包括核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）等多种植物病原真菌,被认为是重要的植病生防因子,具有很好的生防应用潜力。为了揭示链孢粘帚霉HL-1-1寄生核盘菌菌核的分子机理,本文对实验室前期构建的链孢粘帚霉HL-1-1寄生核盘菌菌核差异表达文库中的序列进行了大量的测序和分析,使用Real-time PCR技术对与菌寄生相关的基因在诱导条件下的表达情况做了实时定量监测,采用RACE技术获得了一条与菌寄生相关基因的全长序列。从已构建的差异表达文库中随机挑选了420个阳性克隆进行测序分析,克隆的插入片段大小主要集中于200～600 bp之间。测序后去除载体和小于100bp的序列,获得391条有效序列,平均长度为409bp,通过聚类拼接得到181条单值基因（unigenes）,包括27条重叠群（contigs）和154条单拷贝的EST（singletons）,利用NCBI的Blastx软件对序列进行蛋白序列同源性比对,结果显示有38条单值基因所翻译的蛋白与已知功能的基因相匹配,其中含与生物防治相关的基因,包括脂滴包被蛋白、内切葡聚糖酶、MFS转运蛋白、过氧化物酶等;39条序列在NCBI数据库中未找到匹配的序列,为新基因片段;其余基因编码的蛋白与数据库中预测的蛋白具有同源性,但具体的生物学功能还不清楚。为明确与菌寄生相关的基因--附着胞形成相关基因2-99和脂滴包被蛋白8-3在链孢粘帚霉HL-1-1寄生核盘菌过程中所起的作用,采用SYBR Green I法对这两个基因进行了Real-time PCR相对定量监测,结果显示基因2-99在菌核粉诱导24h的情况下,表达量与诱导前的表达量基本一致,无明显变化,在48h后表达量明显升高,在96h后表达量升高接近8倍。基因8-3的表达情况是在菌核粉诱导条件下前48h,其表达量比诱导前显著降低,但在72h表达量却又超过诱导前,到96h的表达量大约是诱导前的2.5倍。表达量监测结果显示这两个基因均参与了菌寄生过程。采用RACE技术获得脂滴包被蛋白的全长序列,并通过生物信息学对该基因进行功能预测分析。分析结果为:基因8-3具有完整的编码框,位于第314-868bp核苷酸之间,编码框的长度为555bp,编码184个氨基酸残基;通过对蛋白质功能分析,预测出蛋白8-3不含信号肽,不含跨膜区,在184个氨基酸中从第40到111位共72个氨基酸残基构成perilipin superfamily功能区。利用同源重组原理构建了链孢粘帚霉HL-1-1脂滴包被蛋白基因敲除载体,并对敲除实验做了初步的研究,为以后成功敲除链孢粘帚霉基因进行功能验证奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 核盘菌的研究进展
• 1.1.1 核盘菌的危害
• 1.1.2 核盘菌的生物学特性
• 1.1.3 核盘菌的致病因子
• 1.1.4 核盘菌的防治
• 1.2 菌寄生菌的主要作用机制
• 1.2.1 菌寄生作用
• 1.2.2 菌寄生过程中产生的细胞壁降解酶
• 1.2.3 产生抗生素
• 1.2.4 竞争作用
• 1.3 生物信息学概述
• 1.3.1 生物信息学简介
• 1.3.2 生物信息学的应用
• 1.4 实时荧光定量PCR技术在基因监测中的应用
• 1.4.1 实时荧光定量PCR的原理
• 1.4.2 实时荧光定量PCR的应用范围
• 1.5 RACE技术在克隆全长基因中的运用
• 1.5.1 RACE技术的原理
• 1.5.2 RACE技术的运用前景
• 1.6 本实验技术路线
• 1.7 本研究的目与意义
• 第二章 链孢粘帚霉HL-1-1 寄生核盘菌差异表达EST分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 文库来源
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 ESTs的挑选
• 2.2.2 ESTs 序列的测定和聚类分析
• 2.2.3 ESTs序列的生物信息学分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 随机挑取克隆
• 2.3.2 ESTs 序列的测定和聚类分析
• 2.3.3 EST序列质量评价
• 2.3.4 单值基因（unigenes）比对分析
• 2.3.5 ESTs 序列的生物信息学分析
• 2.4 讨论
• 第三章 差异表达基因的定量监测
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 实验用到的仪器
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 培养基及主要试剂配方
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 差异表达基因的诱导
• 3.2.2 RNA的提取方法
• 3.2.3 cDNA的反转录
• 3.2.4 荧光定量PCR引物设计及特异性分析
• 3.2.5 荧光定量监测基因表达量
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 RNA质量分析
• 3.3.2 引物特异性分析
• 3.3.3 差异表达基因的定量监测
• 3.4 讨论
• 第四章 脂滴包被蛋白基因cDNA全长克隆和序列分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 供试材料与试剂
• 4.1.2 RACE特异性引物
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 链孢粘帚霉HL-1-1 总RNA的提取
• 4.2.2 RACE实验方法
• 4.2.3 全长cDNA生物信息学分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 RNA质量分析
• 4.3.2 3’和5’RACE实验结果
• 4.3.3 cDNA拼接
• 4.3.4 全长cDNA生物信息学分析
• 4.4 讨论
• 第五章 链孢粘帚霉HL-1-1 脂滴包被蛋白基因的功能研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 实验仪器
• 5.1.3 试剂及培养基
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 链孢粘帚霉HL-1-1 基因组DNA的提取
• 5.2.2 敲除质粒的构建
• 2 介导的基因敲除'>5.2.3 PEG-CaCl₂介导的基因敲除
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 链孢粘帚霉HL-1-1 脂滴包被蛋白基因敲除载体构建
• 5.3.2 基因敲除
• 5.4 讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历