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Chk-1和PARP-1 SiRNA辐射增敏的实验研究

2020-12-07阅读(101)

Chk-1和PARP-1 SiRNA辐射增敏的实验研究

论文摘要

本研究以Chk-1和PARP-1为作用靶点,构建其RNAi表达载体,干扰细胞损伤修复机制,观察其辐射增敏作用,拟提高肿瘤治疗的敏感性,探索一种有效的肿瘤治疗途径。结果显示1.对经限制性内切酶酶切鉴定正确的Chk-1和PARP-1重组RNAi载体进行测序,结果与理论序列完全一致。然后以脂质体介导分别转染Lewis肺癌细胞株筛选出有效的Chk-1和PARP-1 RNA i载体,即pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536、pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308。2. 2Gy照射+ Chk-1、PARP-1 siRNA组的吸光度值与2Gy照射组、Chk-1和PARP-1 siRNA组比较差异有显著意义（p<0.05）。RT-PCR和免疫组化检测结果显示转染细胞Chk-1、PARP-1表达水平降低。Chk-1和PARP-1 siRNA转染、2Gy照射可诱导细胞凋亡,与正常对照组比,差异显著（p<0.05）,并且siRNA转染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌细胞凋亡（p<0.05）。3.pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536、pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308联合照射组分别与各自联合照射组比,Lewis肺癌细胞的吸光度值有显著差异（p<0.05）。2Gy照射组+ pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536+ pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308组对Lewis肺癌细胞的抑制率最高。表明Chk-1和PARP-1 RNAi对肿瘤有治疗作用,与放疗有协同作用;pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536和pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308有协同作用。4.2Gy照射组与假照组和pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536组、pGPU6/GFP/Neo- PARP-1-1308组、pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536+ pGPU6/GFP/Neo- PARP-1-1308组比,肿瘤生长缓慢（p<0.05）;联合Chk-1和PARP-1的siRNA治疗,与单纯照射组及单纯siRNA治疗组比,肿瘤生长缓慢（p<0.05）。pGPU6/GFP/ Neo-PARP-1-1308和pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536联合放疗,与各自分别联合放疗比,肿瘤明显生长缓慢（p<0.05）。表明pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308、pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536对肿瘤与放疗有协同作用,pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536与pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308有协同作用,pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536与pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308联合治疗具有辐射增敏作用。5.镜下观察各组Lewis肺癌小鼠瘤组织的形态学变化。对照组癌细胞成片状分布,细胞生长旺盛,细胞核浓染,癌细胞几乎不见坏死。放射组癌组织内存在一些异常的肿瘤细胞,这些细胞呈小的巢状分布于正常的肿瘤细胞之间;细胞核、固缩、坏死;坏死的肿瘤细胞较对照组明显增多。Chk-1或PARP-1+放疗组癌组织存在大量异常的肿瘤细胞,这些细胞呈片状分布;细胞核染色较轻、固缩、坏死,部分细胞崩解;坏死的肿瘤细胞较其他组均明显增多。Chk-1和PARP-1联合放疗组癌组织细胞核固缩、坏死,坏死的肿瘤细胞较各自单独与放疗联合组均明显增多。6.激光共聚焦显微镜下观察发现,肿瘤局部照射后2天,Chk-1及PARP-1 siRNA表达载体即散在分布于小鼠肿瘤组织内。7.与2Gy照射组,pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536和pGPU6/GFP/Neo-PARP-1- 1308分别联合放疗可使肿瘤组织表达的Bcl2下调、Bax上调;pGPU6/GFP/Neo- Chk-1-536和pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308联合放疗可明显下调肿瘤组织表达的Bcl2、上调Bax,表明siRNA与照射具有协同作用。8.与假照射组比,Chk-1和PARP-1的siRNA分别使肿瘤细胞的Chk-1和PARP-1 mRNA表达下调;2Gy照射后,应用siRNA治疗,与单纯照射组, Chk-1、PARP-1 mRNA表达量下降,但与未照射、单纯siRNA治疗组比下降不明显,表明siRNA与照射具有协同作用。pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536和pGPU6/GFP/Neo- PARP-1-1308有协同作用,联合治疗增加辐射敏感性。结论成功构建并筛选Chk-1、PARP-1的RNAi载体,针对Chk-1、PARP-1的RNAi可以阻断肿瘤细胞DNA损伤修复,引起细胞凋亡,从而提高放疗对肿瘤的抑制率,证实Chk-1、PARP-1 RNAi具有放疗增敏作用。

论文目录

  • 提要
  • 英文缩写
  • 前言
  • 第1章 文献综述
  • 1.1 放射增敏剂的研究现状
  • 1.1.1 加重DNA 损伤和抑制修复
  • 1.1.2 改变细胞的氧合状态
  • 1.1.3 细胞周期同步化
  • 1.1.4 基因治疗
  • 1.2 Chk-1 的研究进展
  • 1.2.1 Chk-1 激酶的概述
  • 1.2.2 Chk-1 与肿瘤
  • 1.3 PARP 的研究进展
  • 1.3.1 PARP 的结构与代谢
  • 1.3.2 PARP 的生物学功能
  • 1.3.3 PARP 与细胞死亡
  • 1.3.4 PARP-1 与肿瘤治疗
  • 1.4 RNAi 研究进展
  • 1.4.1 RNAi 的作用机制
  • 1.4.2 RNAi 发生的主要过程
  • 1.4.3 RNAi 的优势
  • 1.4.4 RNAi 在肿瘤治疗方面的研究进展
  • 第2章 Chk-1 和PARP-1 RNAi 载体的构建及筛选
  • 2.1 材料和方法
  • 2.1.1 材料
  • 2.1.2 方法
  • 2.2 结果
  • 2.2.1 酶切鉴定重组载体
  • 2.2.2 阳性重组Chk-1 RNAi 载体测序及序列分析
  • 2.2.3 阳性重组PARP-1 RNAi 载体测序及序列分析
  • 2.3 讨论
  • 第3章 筛选有效的Chk-1 和PARP-1 RNAi 载体
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 材料
  • 3.1.2 方法
  • 3.2 结果
  • 3.2.1 Chk-1 RNAi 表达载体的筛选
  • 3.2.2 PARP-1 RNAi 表达载体的筛选
  • 3.3 讨论
  • 第4章 Chk-1 和PARP-1 RNAi 对Lewis 肺癌细胞株的辐射增敏作用
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 材料
  • 4.1.2 方法
  • 4.2 结果
  • 4.2.1 pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536 对 Lewis 肺癌细胞的辐射增敏作用
  • 4.2.2 pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308 对 Lewis 肺癌细胞的辐射增敏作用
  • 4.3 讨论
  • 第5章 Chk-1 和PARP-1 RNAi 对荷瘤鼠的辐射增敏作用
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 材料
  • 5.1.2 方法
  • 5.2 结果
  • 5.2.1 pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536、pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308 对肿瘤生长的影响
  • 5.2.2 肿瘤组织病理改变
  • 5.2.3 Chk-1 及PARP-1 siRNA 表达载体在肿瘤组织的定位
  • 5.2.4 免疫组化检测Bcl2 和Bax 的表达
  • 5.2.5 RT-PCR 检测Chk-1 及PARP-1 的表达
  • 5.3 讨论
  • 参考文献
  • 攻读博士学位期间已发表及待发表论文
  • 致谢
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 作者简介

    • 相关论文文献

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