论文摘要
第一部分D-半乳糖诱导大鼠内耳线粒体DNA大片段缺失突变的研究目的：研究D-半乳糖模型大鼠内耳组织中可能存在的线粒体DNA大片段缺失突变。方法：1月龄雌性Wistar大鼠48只随机分为4组：低、中、高剂量D-半乳糖组和生理盐水对照组各12只,分别于每日皮下注射5%D-半乳糖150 mg/kg、300 mg/kg、500 mg/kg和等体积生理盐水,共8周。听性脑干反应（auditory brainstem response,ABR）检测大鼠听阈。联合应用普通PCR、巢式PCR和长片段PCR技术筛查大鼠内耳组织中的线粒体DNA大片段缺失突变。应用DNA测序技术证实线粒体DNA缺失突变的存在。结果：D-半乳糖组大鼠与对照组之间ABR阈移差异无统计学意义（p>0.05）。不同剂量D-半乳糖组大鼠内耳组织中均可检测出线粒体DNA 4834 bp缺失突变,并且首次发现3种新的线粒体DNA缺失突变。线粒体DNA 4834 bp缺失突变和3种新发现的缺失突变的断裂融合位点两端均存在核苷酸重复序列,并且均涉及线粒体编码的细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ（COX3）基因。结论：D-半乳糖模型大鼠内耳组织中存在多种线粒体DNA大片段缺失突变,这些缺失突变存在相似的特征。第二部分D-半乳糖大鼠内耳线粒体DNA 4834 bp缺失在大片段缺失突变中作用的研究目的：探讨线粒体DNA 4834 bp缺失突变在大片段缺失突变中的贡献率,以及大片段缺失突变对缺失突变热点区域的细胞色素C氧化酶（COX）活性的影响。方法：应用Taqman探针法实时定量PCR技术检测不同剂量D-半乳糖组大鼠内耳组织的线粒体DNA 4834 bp缺失突变率、线粒体DNA大片段缺失突变率及线粒体DNA拷贝数目。比色法定量检测细胞色素C氧化酶（COX）活性变化。结果：与对照组相比,三个不同剂量D-半乳糖组大鼠内耳组织中线粒体DNA4834 bp缺失突变率和线粒体DNA大片段缺失突变率明显增高（p<0.05）,其中高剂量D-半乳糖组升高最明显。低、中、高剂量D-半乳糖组大鼠内耳组织中线粒体DNA4834 bp缺失在线粒体DNA大片段缺失突变中所占比例逐渐减少,分别为76.71±1.96%,74.94±2.04%,67.86±2.38%,而对照组为87.74土3.52%（p<0.05）；D-半乳糖各剂量组内耳组织的线粒体拷贝数目与对照组相比均明显增高（p<0.05）,并随D-半乳糖剂量增大而显著增高；COX活性与对照组相比均明显降低,并随D-半乳糖剂量增大而显著降低。结论：线粒体DNA 4834 bp缺失突变是D-半乳糖大鼠模型内耳组织中的一种最主要的线粒体DNA大片段缺失。此缺失突变可考虑作为评估内耳组织线粒体DNA损伤的理想的分子标志物。第三部分D-半乳糖大鼠内耳线粒体DNA缺失突变的发生机制研究目的：探讨大鼠内耳组织线粒体DNA缺失突变可能的发生机制。方法：88只雄性Wistar大鼠随机分为4组：低、中、高剂量D-半乳糖组和生理盐水对照组各12只,分别于每日皮下注射5%D-半乳糖150 mg/kg、300 mg/kg、500 mg/kg和等体积生理盐水,共8周。应用实时定量PCR技术检测各组大鼠内耳组织中线粒体DNA 4834 bp缺失突变率和线粒体DNA相对拷贝数目。应用实时定量逆转录PCR技术和Western blotting方法检测各组大鼠内耳组织中线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A, TFAM）、DNA聚合酶y （DNA polymerase y, DNA pol y）和DNA修复酶8-氧鸟嘌呤糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosylase, OGG1）在基因和蛋白水平的变化。结果：与对照组相比,D-半乳糖组大鼠内耳组织中线粒体DNA 4834 bp缺失率和线粒体DNA相对拷贝数目明显增高（p<0.05）,高剂量组升高最明显。D-半乳糖各剂量组内耳组织中DNA pol y和OGG1的基因和蛋白表达水平均明显低于对照组（p<0.05）,并随D-半乳糖剂量增大而明显降低。各剂量组内耳组织中TFAM的基因和蛋白表达水平与对照组相比均明显增高（p<0.05）,并随D-半乳糖剂量增大而明显增高。结论：在内耳老化过程中线粒体DNA缺失突变的积累可能是由于线粒体DNA修复功能减退和TFAM过表达所致的线粒体DNA复制增加造成的。