论文摘要
研究背景我国是肝癌大国,全球每年新发肝癌病例有50%来自中国。许多患者发现时已经是晚期,或治疗后发生转移,此时,手术、放疗、介入都无能为力。多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼可以阻断细胞生长的重要通路Raf/MEK/ERK的多个酪氨酸激酶受体,并抑制血管生成刺激因子,发挥抑制肿瘤细胞增殖和抗肿瘤血管生成双重效应。实验室证明索拉非尼对多种组织来源的肿瘤细胞具有抑制生长的作用,基于大宗临床试验的证据,索拉非尼已被批准用于肾细胞癌和肝癌的治疗。肝素作为一种抗凝药物,近年却被发现具有抑制肿瘤的特性,肿瘤患者用肝素治疗获得了生存期的延长,体外实验证明肝素可以结合肿瘤微环境中的多种蛋白,从而发挥抗肿瘤作用。包括肝癌在内的恶性肿瘤是一个多因素生物学过程,其生长发展离不开侵袭、转移和血管生成,最佳的治疗策略,应该能够在抑制肿瘤生长的同时,阻断其侵袭和新生血管过程,多管齐下,以期获得更大范围疗效。本研究选择分别针对肿瘤增殖本身和肿瘤微环境刺激因素的两种作用机制不同的药物,索拉非尼和肝素/达肝素,设计了一系列实验,观察其对肝癌细胞增殖、侵袭性和血管生成的影响,以验证联合用药能够增加疗效的假设。研究材料与方法主要试剂及实验细胞索拉非尼（多吉美,甲苯磺酸索拉非尼片）用10%DMSO溶解稀释,然后以DMEM高糖培养基（H-DMEM）溶解至所需浓度。肝素,低分子量肝素达肝素（法安明,达肝素钠注射液）以H-DMEM溶解至所需浓度。选择高侵袭性肝细胞癌细胞系HCCLM6作为实验用细胞。MTT实验对数生长期的肝癌细胞系HCCLM6,胰酶消化后接种于96孔板,5×103个/孔,分别与不同浓度的索拉非尼、肝素、达肝素共同孵育72h（单药组）,或不同浓度肝素/达肝素孵育24h后,加入一定浓度索拉非尼继续孵育48h（联合用药组）,然后加入MTT继续孵育4h,DMSO溶解,酶标仪测定490nm的OD值,与空白对照相比,计算细胞存活率。流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率的变化肝癌细胞HCCLM6每孔1×106个接种于6孔板,分别加入索拉非尼（4μmol/L）、或肝素/达肝素（10 IU/ml）、或两药联合,24h后收集细胞,PI染色后以流式细胞仪分析细胞周期;或同样加药方法,处理后AnnexinⅤ-FITC及PI双染,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。免疫印迹实验检测p-ERK1/2及ERK1/2蛋白表达收集药物作用后的细胞,提取蛋白进行SDS/PAGE凝胶电泳,然后电转移至PVDF膜,依次加入一抗及二抗,与发光试剂温浴后曝光、显影和定影,进行结果分析。细胞黏附实验96孔培养板上铺设Matrigel,接种HCCLM6细胞2×103个/孔,分别加入索拉非尼、肝素、达肝素及联合药物,1 h后以苏木素—伊红染色基质膜黏附细胞数,与空白对照相比,计算细胞黏附率。细胞侵袭实验在24孔Transwell上室铺设Matrigel,使之在微孔滤膜上凝固为基底膜结构,向上室接种HCCLM6 1×105个/孔,分别加入预设药物,12h后Giemsa染色后计数穿膜细胞数,与空白对照相比,计算细胞侵袭率。鸡胚绒毛膜尿囊膜（CAM）实验8日龄胚蛋,随机分组,每组10只分组加入索拉非尼、肝素、达肝素及联合药物,72h后计数CAM的血管数量。统计学分析数据采用SPSS 11.5软件进行单方差分析（One way ANOVA）,多重比较采用LSD方法,MTT实验不同浓度单药组与对照组比较使用Dunnett方法,以α=0.05为检验水准,P＜0.05认为差异有统计学意义,文中的数据表述如未加说明均采用（?）±SD格式。结果MTT实验镜下观察,对照组细胞个体大,排列紧密,形状不规则;索拉非尼组细胞密度依药物浓度递减,肝素/达肝素组细胞突起减少,细胞间距增大。MTT染色结果显示各浓度索拉非尼细胞存活率较对照组细胞存活率显著降低（均P＜0.05）,与肝素/达肝素联用,细胞存活较各单药组进一步降低（均P=0.000）,达肝素对索拉非尼的增效作用大于相同浓度的肝素组（均P＜0.05）。细胞周期应用流式细胞仪分析细胞周期,各用药方式对细胞G1期（F=1.619,P=0.229）和G2期（F=1.326,P=0.318）影响差异不显著,对细胞S期的影响存在显著差异（F=3.508,P=0.035）,索拉非尼及达肝素组较对照组S期细胞升高均有统计学意义（均P＜0.05）,肝素/达肝素对索拉非尼没有显著影响（均P＞0.05）。细胞凋亡率流式细胞仪测细胞凋亡,早期凋亡率:各用药方式对细胞早期凋亡率的影响存在显著差异（F=13.916,P=0.000）,单药索拉非尼、肝素、达肝素较对照组显著增高（均P＜0.05）,肝素及达肝素单药之间没有显著差异（P=0.427）,联合组较单药组显著增高（均P＜0.05）,肝素联合索拉非尼与达肝素联合索拉非尼之间没有显著差异（P=0.587）;晚期凋亡率:各用药方式对细胞晚期凋亡率的影响存在显著差异（F=373.217,P=0.000）,与对照组相比较,索拉非尼组晚期凋亡率显著增高（P=0.000）,肝素/达肝素晚期凋亡率与对照组没有显著差异（均P＞0.05）;联合用药时,肝素/达肝素对索拉非尼没有显著增效作用（均P＞0.05）。免疫印迹实验ERK1/2的表达各组变化不明显（F=1.302,P=0.326）,而p-ERK的表达在各组间差异显著（F=47.011,P=0.000）,用药组均较对照组降低（均P＜0.05）,联合用药组较各个单药组又有一定程度的降低（均P＜0.05）,肝素组与达肝素组p-ERK的表达差异不显著（P＞0.05）黏附实验各用药方式对细胞黏附率的影响存在显著差异（F=149.871,P=0.000）,与对照组相比较,肝素/达肝素组肿瘤细胞与基质间黏附率显著下降（均P=0.000）,肝素与达肝素之间没有显著差异（P=0.696）,而索拉非尼对细胞的黏附作用的影响没有统计学差异（P=0.097）;联合用药组,索拉非尼无论对肝素还是达肝素都没有显著的增效作用（均P＞0.05）。侵袭实验各用药方式对细胞侵袭率的影响存在显著差异（F=78.773,P=0.000）,较对照组,索拉非尼、肝素/达肝素显著抑制了细胞的侵袭能力（均P=0.000）,肝素及达肝素之间没有显著差异（P=0.336）;联合用药时,索拉非尼显著增强了肝素及达肝素抑制细胞侵袭的作用（均P＜0.05）,索拉非尼联合肝素或达肝素之间没有显著差异（P=0.391）。CAM实验固定前观察各组CAM血管,与对照组比较,索拉非尼组血管减少,可见大血管绕道行走和明显的迂曲变形;肝素/达肝素组大血管增多,小血管明显减少,血管变形少见;联合用药组血管进一步减少,可见少量迂曲变形的血管。分析各组血管生成数量的差异,发现各用药方式对血管数量的影响存在显著差异（F=206.659,P=0.000）,添加药物后各实验组的血管生成较对照组均显著减少（均P=0.000）;肝素组、达肝素组间无统计学差异（P=0.447）;联合用药各组较各单药各组血管生成显著减少（均P＜0.05）,（索拉非尼+肝素）组与（索拉非尼+达肝素）组间的差异不显著（P=0.633）。讨论随着诊疗手段的进步,肝癌患者的生存期大大延长,伴随而来的是远处转移或治疗后复发率的增加。肝癌的转移越来越引起研究者们的重视。肿瘤的生长和播散设计一系列的恶性生物学行为,如无限增殖、侵袭性、远处生长、结构紊乱、恶性血管增生等。在以往的研究中,我们把注意力几乎全部集中在肿瘤细胞本身。肿瘤微环境,即肿瘤细胞所处的环境,在肿瘤的发生、发展、转移等各方面起着重要的作用,肿瘤细胞之间以及与微环境各组分之间通过各种细胞因子及受体进行交流。肝癌细胞的进展同样依靠与微环境之间的交流。针对这些相互作用因子,产生了一系列的分子靶向药物,有的直接针对肿瘤细胞上特异性受体,如索拉非尼、吉非替尼,有的则针对微环境中的肿瘤相关因子,如贝伐单抗、西妥昔单抗、肝素等。小分子多靶点激酶抑制剂索拉非尼可以阻断细胞生长的重要通路Raf/MEK/ERK的多个酪氨酸激酶受体,并抑制VEGFR2、PDGFR、FLT3、Ret、和c-Kit等血管生成刺激因子。2007年2月12日,纳入602例患者的Ⅲ期临床双盲随机对照研究SHARP试验显示,与安慰剂相比,索拉非尼可显著延长晚期肝细胞癌或原发性肝癌患者的总生存期。肝素/低分子量肝素通过与肿瘤微环境中生长因子、阻滞因子、蛋白水解酶和基质（ECM）蛋白结合,从而发挥抗肿瘤细胞生长、转移、侵袭以及抑制血管生成的作用。肿瘤细胞分泌过量的类肝素酶降解ECM的重要组分硫酸类肝素蛋白聚糖,促成了肿瘤的播散和血管生成,肝素等类肝素酶抑制剂可以抑制这一作用。在一些临床研究中发现,使用肝素或低分子量肝素对肿瘤患者有延长生存期的作用。目前认为这可能与直接抗肿瘤、调节免疫系统、抑制肿瘤微环境中的各种蛋白和抗血管形成等因素有关。一个主攻肿瘤细胞,一个阻抑肿瘤微环境蛋白,将这样两种抗肿瘤药物联用,理论上可以相互辅助,全面抑制肿瘤。我们通过实验验证了这一假设,索拉非尼与肝素/达肝素联用较单药更有效地抑制了肿瘤细胞的增殖和血管增殖,在对黏附力和侵袭力等肿瘤转移相关指标方面也表现出了一定的联合作用,而在肝素、达肝素二者之间,无论单用或与索拉非尼联用,效果差别均不显著。我们可以在进一步的动物实验中明确两药联用的整体水平效果及副作用,为临床应用打下基础。同时,由于肝素/达肝素目前临床上只是用于肿瘤患者的抗血栓治疗,还未正式作为一种抗肿瘤药物使用,尝试将其与疗效明确的抗肿瘤药物索拉非尼联用,共同作用封闭肿瘤发生发展的多个靶点,起到增敏作用,在肿瘤治疗理念方面也是比较新颖的。